Elektrochemická analýza NK a jejich složek
F. Jelen
ÚVOD-Laboratoř biofyzikální chemie a molekulární onkologie
METODY ELEKTROCHEMICKÉ ANALÝZY
- POLAROGRAFIE
- VOLTAMETRIE
- PULZNÍ METODY
- CHRONOPOTECIOMETRIE
- ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE
NUKLEOVÉ KYSELINY
a) KVANTITATIVNÍ ANALÝZA
přímá detekce
nepřímá
značky – OsO4, echinomycin, ferocen
borátové struktury
depurinace
b) STRUKTURNÍ ANALÝZA
– rozvíjení na elektrodě
– detekce hybridizace
BÁZE NUKLEOVÝCH KYSELIN
Báze NK -rozpouštěcí voltametrie
Stanovení bází NK v přítomnosti Cu(II)
LABORATOŘ
BIOFYZIKÁLNÍ CHEMIE A MOLEKULÁRNÍ ONKOLOGIE
Zabývá se :
1. elektrochemií nukleových kyselin a bílkovin
2. elektrochemickými biosensory DNA
3. novými mikrometodami pro analýzu bílkovin
4. tumor-supresorovými bílkovinami: jejich
interakcemi in vitro a v buňkách
P53: kontrola nádorového bujení
Gen p53 hraje důležitou úlohu při
kontrole buněčného cyklu: při
poškození buněčné DNA zabrání
dělení buňky, dokud nedojde k opravě,
nebo ji dovede k apoptóze. Tím také
brání dělení malformovaných
nádorových buněk a růstu nádorů.
Mutace genu p53, která vede ke ztrátě
jeho regulační funkce a antionkogenní
aktivity, je nacházena u velké části
lidských malignit a je považována za
nejčastější genetickou poruchu
vedoucí ke vzniku nádoru.
Proteiny (bílkoviny) jsou z
aminokyselin složené
vysokomolekulární přírodní látky s
relativní molekulární hmotností 103
až 106. Proteiny jsou podstatou
všech živých organismů. V
proteinech jsou aminolyseliny
vzájemně vázány aminoskupinami –
NH2 a karboxylovými skupinami –
COOH amidovou vazbou –NH–CO–
(amidy), která se v případě proteinů
nazývá peptidická vazba. Podle
počtu aminokyselin v molekule
rozlišujeme oligopeptidy (2–10
aminokyselin), polypeptidy (11–100)
a proteiny (více než 100
aminokyselin).
Nukleové kyseliny jsou
makromolekulární látky tvořené
polymerním řetězcem, který ve své
struktuře uchovává genetickou informaci.
Nukleové kyseliny se nalézají ve všech
živých buňkách a virech. Nejběžnějšími
nukleovými kyselinami jsou kyselina
deoxyribonukleová (DNA) a kyselina
ribonukleová (RNA). Polynukleotidový
řetězec je z chemického hlediska
polymerem nukleotidů. Tyto nukleotidy
jak pro DNA, tak i pro RNA jsou vždy
složeny ze čtyř druhů a jejich různým
pořadím v řetězci lze dosáhnout
nezměrného počtu kombinací. Právě
sekvence (různý sled) jednotlivých druhů
nukleotidů, který se nazývá tzv. primární
strukturou, v sobě uchovává genetickou
informaci.
Nukleotidy RNA obsahují a jsou zde
kombinovány tyto čtyři báze: Cytosin (C),
guanin (G), adenin (A) a uracil (U).
Nukleotidy DNA obsahují a v DNA jsou
kombinovány tyto čtyři báze: Cytosin (C),
guanin (G), adenin (A) a tymin (T).
Vedoucí laboratoře:
Doc. RNDr. Miroslav Fojta, PhD
Biofyzikální ústav, v.v.i. AV ČR www.ibp.cz
A
U
POLAROGRAFIE
t
E
1890-1967
METODY
d.c.
polarografie
id = 708nD1/2m2/3t1/6c
ILKOVIČOVA ROVNICE
t
E
dsDNA
ssDNA
0.5A
POTENTIAL
CURRENT
AE WE RE
METODY
OSCILOPOLAROGRAFIE METODY
Time
Potential Switching point
Potential
Current
Current
Potential
U=I.R
CYKLICKÁ VOLTAMMETRIE METODY
-1200
-800
-400
0
400
-1.7 -1.5 -1.3 -1.1 -0.9 -0.7 -0.5 -0.3 -0.1
E / V
I/nA
REDUKČNÍ SIGNÁLY DNA
oxidace
redukce
AC
G
CYKLICKÁ VOLTAMMETRIE
60 – 90 léta
Moderní voltametrické metody
- pulzní metody = difereční pulzní voltametrie
= square wave voltametrie
- chronopotenciometrické metody
Použití HMDE (hanging mercury drop electrode)
Rozpouštěcí (stripping) voltametrie
Přenosová voltametrie
VOLTAMETRICKÉ METODY
Proud
čas
Ic=k * 1/t
If=k*t-1/2
Ic=k*1/t
If=k*t-1/2
DIFFERENČNÍ (DERIVAČNÍ) PULZNÍ VOLTAMMETRIE
I
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 50 100t / s
Y
Y=k*1/√t
Y=k*1/t
Y=k*e-t
III
II
a
b
CHRONOPOTENCIOMETRIE
E-E1/2 / V
t/s
dt vs dE
E-E1/2/V
t / s
i = konst.
VYBRANÉ ELEKTROANALYTICKÉ METODY
Statické (i = 0) dynamické ( i ≠ 0)
Potenciometrie selektivní elektrody
potenciometrické titrace
řízený potenciál řízený proud řízený náboj
malá amplituda velká amplituda
hydrodynamická c-c
voltametrie
chronopotenciometrie c-c coulometrie
coulometrické
titrace
malá amplituda velká amplituda
chronoamperometrie
chronocoulometrie
c-p coulometrie voltametrie
hydrodynamické metody stac.elektroda
voltametrie
pulsní voltametrie
cyklická voltametrie
rotační voltametrie
ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE
Rozpouštěcí voltametrie je elektrochemická metoda, která se s úspěchem používá tehdy, když
koncentrace látky je velmi nízká a nelze ji standardním postupem stanovit. Podmínkou je, aby
stanovovaná látka tvořila s elektrodou amalgamu, nebo na druhé straně špatně rozpustnou sůl. V
prvém případě hovoříme o anodické rozpouštěcí voltametrii - ASV, ve druhé o katodické rozpouštěcí
voltametrii - CSV.
V obou případech stanovovanou látku nahromadíme elektrochemicky na elektrodě budˇ ve formě
amalgamy nebo ve formě sraženiny (špatně rozpustné soli) a posléze tyto formy elektrochemicky
zrušíme, tím, že obrátíme směr polarizace. V obou případech začínáme měřit za půlvlnovým
potenciálech reakce a platí následující rovnice:
deposit
ASV : Mn+ + n e- M(Hg)
strip
deposit
CSV: An- + Hg HgA + ne-
strip
Ik
-E
Ia
+E
redukce
oxidace
0-2
Hg → Hg2+
Na+ → Na(Hg)
2H+ → H2
Zn2+ → Zn
ANODIC STRIPPING VOLTAMMETRY
Hg elektroda
Zn(Hg) → Zn2+
Ik
-E
Ia
+E
redukce
oxidace
0
-2
Hg → Hg2+
Na+ → Na(Hg)
2H+ → H2
Hg elektroda
CATHODIC STRIPPING VOLTAMMETRY
KATODICKÁ ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE
Citlivost metody se mění s množtvím látky vyloučené za jednotku času na
elektrodě. Jak je to s polohou signálu, tj. s potenciálem píku.
Je dán rovnicí
][HgF)(RT/EpE
/Hg,Hg
2
20
ln2
22
AHgHgA
Asoc. konstanta K1 = [HA-]/ [H+][A2-]
Produkt rozpustnosti Ks = [Hg2+] [A2-]
Po úpravách dostaneme
)][HApHKK(.EE s/Hg,Hgp logloglog0300 10 2
Z rovnice vyplývá,
poloha bude negativnější - s rostoucím pH
s rostoucí koncentrací aniontu
s klesající rozpustnosti sloučeniny
poloha bude positivnější - s vyšší hodnotou asoc. konstanty
Elektrodový systém - pracovní elektroda WE
- referenční elektroda RE
- pomocná elektroda AE
Elektrochemická nádobka
Náhradní elektrodové schéma
WE
RE
AE
RE
WE CE
Elektrochemický měřící systém
AE WE RE
HMDE
1. ELEKTRODY V KONTAKTU S ROZTOKEM VLASTNÍCH IONTŮ
Dva případy
a) KOV v kontaktu vlastních iontů, např. Cu│Cu2+
b) NEKOV v kontaktu vlastních iontů, např. H2│H+ nebo Cl2│Cl-
n
M
a
F
RT
EE ln0 (Nernstova rovnice)
MneM n
H
H
a
p
F
RT
EE
2/1
0 2
ln
4. MODIFIKOVANÉ ELEKTRODY
např. enzymové, přenos elektronů je zprostředkován
ELEKTRODY
2. KOVOVÉ ELEKTRODY v kontaktu aniontů, které tvoří špatně rozpustné soli
např. Hg│ Hg2Cl2│Cl- nebo Ag│ AgCl│Cl-
Cl
a
F
RT
EE ln0
3. REDOXNÍ (INERTNÍ) ELEKTRODY
donor nebo akceptor elektronů, např. Hg, Au, Pt, carbonové el., oxidy polovodičů, atd.
REDOXNÍ ELEKTRODY
Materiál pracovních elektrod pro voltametrii
Výběr materiálu elektrody závisí na
- potenciálové oblasti, ve které bychom měli měřit
- na použitém rozpouštědle
-kvalitě a čistotě materiálu.
Výběr potenciálové oblasti souvisí s:
-rozkladem rozpouštědla
-rozkladem základního elektrolytu
-rozpouštěním elektrody
Rtuť:
Výhody:
Velmi vysoké záporné vodíkové přepětí
(měření k negativnějším potenciálům než ostatní elektrody)
Reprodukovatelnost měření
Hladkost povrchu
Nevýhody:
Patří mezi jedy
Vliv na životní prostředí
ELEKTRODY
Uhlík
Uhlík existuje v různých vodivých formách. Elektrochemické reakce jsou pomalejší ve
srovnání s kovovými, kinetika přenosu náboje je závislá na struktuře povrchu a jeho
úpravě
Různé typy elektrod:
glassy carbon (příprava: karbonizace fenol-formaldehydových polymerů při 1000-3000
°C a vysokém tlaku, amorfní charakter, není vždy homogenní)
uhlíková vlákna (2-20 mm)
uhlíková čerň
různé formy grafitu
– např. pastová elektroda
pyrolytický grafit (PG nebo HOPG, anisotropní vlastnosti, edge and basal plane)
ELEKTRODY
UHLÍKOVÉ PASTOVÉ ELEKTRODY (CPE)
-příprava CPE
- směs uhlíkového prášku a minerálního oleje
-modifikátory
- chemické sloučeniny a analytické reagenty
- ion-exchangery
- jílové minerály (zeolites)
- matrice obsahující křemík
- substraty z živých organizmů
-charakteristiky
- fyzikálně-chemické - heterogenita (kompositní charakter)
- lipofilita (hydrofobicita)
- nízký ohmický odpor (vysoká vodivost)
- nestabilita v nevodných prostředích (desintegrace)
- časové efekty (limitovaná životnost)
Screen-printed elektrody
UHLÍKOVÉ NANOTRUBIČKY
Diamond sp3
bonding, hard
and insulating
Graphite: sp2 Bonding
soft between graphene
layers
C60 “bucky-ball”: hollow sphere
~1x10-9 m (1nm) in diameter
Carbon Nanotube:
1-50nm in diameter,
10 - 100
micrometer long
DOPAMINE
SWNT AND BIOMOLECULES
3,4 dihydroxyphenylethylamine
VIZMUTOVÉ ELEKTRODY
Charakteristika - nahrazují rtuťové elektrody
- stripping analýza
- nízkoteplotní amalgámy s mnoha kovy (např. Pb,
Cd, Tl, Sb, In, Ga
Konstrukce – ve většině případů uhlík jako podložka pro
bizmutový film
- ve většině případů je to glassy carbon
Film – se připravuje ex situ (prepokovování-preplated)
- nebo in situ (přidáním 0.25 – 1.0 ppm vizmutu(III) přímo ke
vzorku za současné redukce vizmutu
Bi(3+) + 3(e-) > Bi(0)
M(n+) + n(e-) > M(Bi)
Uhlíková pastová elektroda + Bi2O3 (preplated nebo mix s pastou)
„Hot“ vizmut elektroda
ELEKTRODY
DIAMANTOVÉ, BOREM DOPOVANÉ ELEKTRODY -
BDD
Charakteristika – jedná se o diamantový film dopovaný borem
- mechanická i chemická stabilita, nízký zbytkový
proud a biokompatibilita (měření v živých tkáních)
- široké potenciálové okno, hodnoty kolem 3,5 V
- stanovení organických látek
Při elektrochemickém stanovení organických látek na pevných elektrodách dochází
velmi často k ireverzibilní adsorpci reakčních produktů či některých složek vzorku na
povrchu elektrody, což má za následek její pasivaci. Na adsorpci polárních látek jsou
citlivé téměř všechny sp2 uhlíkové elektrody Je to způsobeno hlavně přítomností
polárních skupin na jejich povrchu. BDD je díky svému sp3 charakteru vůči adsorpci
polárních látek na jeho povrchu značně rezistentní.
Pro použití BDDFE v elektrochemii organických látek existují dva hlavní směry:
elektrochemická oxidace organických látek obsažených v odpadních vodách na BDD
anodě založená na jejich úplné konverzi nebo destrukci a užití BDDFE jako
elektrochemických senzorů ve voltametrii nebo při ampérometrické detekci v
průtokových metodách (HPLC, průtoková injekční analýza,
kapilární elektroforéza).
ELEKTRODY
Indium-cín oxid - ITO
Velký potenciálový rozsah poskytuje elektroda připravená vakuovým
nanesením indium-cín oxidu – ITO na křemenné substrátu.
Byly studovány oxidační odezvy DNA měřené ITO elektrodami
modifikovanými nitrocelulózovými nebo nylonovými membránami
nebo se samoorganizovanými monovrstvami dikarboxylátu .V těchto
experimentech byla DNA navázána na elektrodu buď kovalentní
vazbou nebo adsorpčními sílami v modifikované vrstvě. Čistá ITO
elektroda DNA neadsorbovala.
Oxidace guaninu v DNA byla zprostředkována redoxním chelátem
kovu [Ru(bipy)3], který přenášel elektrony na povrch elektrody z DNA
buď v roztoku nebo jako fixovaný na film modifikátoru. Rovněž byla
použita metoda fixace redoxního mediátoru na ITO elektrodu
modifikovanou elektro polymerizovaným poly[Ru(bipy)3] filmem.
ELEKTRODY
ELEKTRODY
TITANOVÉ ELEKTRODY
Polymorfy TiO2 – anatas, rutil, brookit,
Zpravidla se používá single-krystal anatasu s vysokým stupněm
čistoty. Dají se připravit vypalované nanopásky TiO2 (nanobelts)
Byly studovány oxidační odezvy adeninu a guaninu měřené
uhlíkovými elektrodami modifikovanými směsí anatasu a rutilu (3:1). V
těchto experimentech byly nukleobáze navázány na elektrodu
adsorpčními silami. Byl navržen mechanismus katalytické oxidace.
P A
B
produkty
Q
roztokpevná fáze
C. HETEROGENNÍ
B
produkty
roztok
AP
Q
B. HOMOGENNÍ
mediátor
roztok
E/Vvs.NHE
A
B produkty
Ellektroda
1.4
0
Er
EA/B
EP/Q
A. NEMODIFIKOVANÉ
A B+ + eEr
- EA/B =
EP/Q - EA/B = 2
Bez katalýzy
( 1 >> 2)
Er = E P/Q - EA/B
katalýza
( 1 = 2)
CHEMICKY MODIFIKOVANÉ ELEKTRODY
ELEKTRODY
NANOČÁSTICE
voltamogram
Separační metody před vlastním měření
data
EVLS
b) Magnetické kuličky
DYNAL
adsorpce DNA promytí systému detekce
a) Přenosová technika (AdTSV)
NUKLEOVÉ KYSELINY
- DNA
- RNA
- PNA
Báze NK
Adenin, A
Guanin, G
Cytosin, C
Thymin, T
Uracil, U
puriny
pyrimidiny
N
N
N
N
N
N
BIOMAKROMOLEKULY
RNA vs DNA
C C
G G
U T
A A
N
N
O
NH2
O
P OCH2
O
O
etc.
O
O
P
O
OCH2
O
O
O
P OCH2
O
O
O
P
O
OCH2
O
O
O
etc.
O
NH2N
N
N
N
O
O
N
ON
CH3
N
N
N
N
NH2
Deoxyribonucleic acid
DNA
N
N
O
NH2
O
OH
P OCH2
O
O
etc.
O
O
P
O
OCH2
O
OH
O
O
P OCH2
O
OH
O
O
P
O
OCH2
O
OH
O
O
etc.
O
NH2N
N
N
N
O
O
N
ON
N
N
N
N
NH2
Ribonucleic acid
RNA
DNA x PNA
O
C
H2
BASE
O
O P
O
O
O
C
H2
BASE
O
O P
O
O C
H2
O
BASE
O
O
DNA
POLYDEOXYRIBÓZO FOSFÁT
H N
N
O
BASE
N
O
O
N
H
N
O
BASE
PNA
POLYAMINOETHYLGLYCIN
aminoethyl
glycin
acetyl
PÁROVÁNÍ BÁZÍ A REDOXNÍ MÍSTA
REDUKČNÍ MÍSTA OXIDAČNÍ MÍSTA
G
O
C1´
H
N
N
N
N
N
H
H
C1´
H---------------------------H N
H -----------------------
H---------------------O
N
N
H
C
H
N
N
N
N
C 1
H
78
9
4
5 6
1
2
N
H
H-------------------
---------------------------
H
N
N
12
O
H
CH3
C 1´
O
3
4 5
6
A
T
NH2
N
NN
N
H
+2H++2e-
NH2
N
NN
N
H
H
H
2H+ + 2e+
NH2
N
NN
N
H
H
H
H
H
H
-
N
NO
H
NH2
+ 2H+ + 2e
- N
NO
H
NH2H H
-NH3
N
NO
H
+ H+ + e- 1
2
N
N
H
H
O
H 2
REDUKCE
C -CYTOSIN
A –ADENIN
N
NN
N
H
C H
O
H
H N
2
C
H
7,8-dihydroguanosine
N
NN
N
H
C H
H N
2
C
H
9-ribosyl-2-aminopurine
O
N
NH
N
N
O
OH OH
HOCH2
H2
N
guanosine
REDUKCE
Gua -GUANOSIN
-1200
-800
-400
0
400
-1.7 -1.5 -1.3 -1.1 -0.9 -0.7 -0.5 -0.3 -0.1
E / V
I/nA
REDUKČNÍ SIGNÁLY
oxidace
redukce
AC
G
dsDNAssDNA
0.5A
POTENTIAL
CURRENT
DME HMDE
TIME TIME
Ered
Ei
E
A1
1s
60 s
III
II
a
b
I
SIGNALAPPLIEDRESPONSEOBTAINED
c
3
1
d
3
3
2
1e
f
-E
B
A2
ssDNA
dsDNA
DC polarografie
DP polarografie DP voltametrie
RIII
RII
ssRNA
dsRNA
ssDNA
dsDNA
-1.2-1.4-1.6
III
II
0.0-1.0-1.5 -0.5
POTENTIAL (V)
CURRENT(A)
A B
IR
IR
5’-TCCAGTAGTTCTAGAAAGGGAGTT-3’
5’-AACTCCCTTTCTAGAACTACTGGA-3’
5’-TCCAGTAGTTCTAGAAAGGGAGTT-3’
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
3’-AGGTCATCAAGATCTTTCCCTCAA-5’
A) Denaturace
B) Hybridizace
C) Depurinace
D) Adsorpce
0.0
0.1
0.2
0.3
9 10 11 12 13 14
pH
IG(A)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
9 10 11 12 13 14
pH-ICA(A)
A
B
a) změna pH (alkalická denaturace)
AC
G
3’-AGGTCATCAAGATCTTTCCCTCAA-5’
5’-TCCAGTAGTTCTAGAAAGGGAGTT-3Denaturace
Tm
teplota
Denaturace
-0.4
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
-1.5 -1.3 -1.1 -0.9 -0.7 -0.5 -0.3
Ei / V
dsDNA pH 8.7
dsDNA pH 9.8
dsDNA pH 10.8
dsDNA pH 12.0
ssDNA pH 8.7
TU
ALKALINE pH
(deprotonation of bases)
A
B
-1200
-800
-400
0
400
-1.7 -1.5 -1.3 -1.1 -0.9 -0.7 -0.5 -0.3 -0.1
E / V
I/nA
OXIDACE
C -CYTOSIN
T -THYMINE
A - ADENINE
G –GUANINE
G
0.6 0.7 0.8 0.9 1.1 1.2 1.3
Potenciál (V)
Proud(A)
A
CPE
oxidace
OXIDAČNÍ SIGNÁLY
Brett A.M. et al., Anal Biochem. 332 (2004) 321Differential pulse
voltammogram obtained with a 3-mm diameter GCE electrode for the
mixture of 2 · 10-5 M guanine (G) and adenine (A), 2 · 10-4 M thymine (T) and
cytosine (C) in pH 7.4, 0.1 M phosphate buffer supporting electrolyte. (. . .)
Recorded voltammogram; (—) baseline-corrected voltammogram. Pulse
amplitude 50 mV; pulse width 70 ms; scan rate 5m Vs-1.
BÁZE, CPE, SQW-80 Hz, 0.1M fosfát pufr pH=6.4, tA 120s
AG
C
T
A
G
TG,A – 20 M
C,T – 200 M
A
G
MIXTURE G,A C,T
G,A – 20 M
C,T – 200 M
A
G
C
T
(A) elektrostatická interakce
(B) vazba do malého žlábku dvoušroubovice DNA
(C) interkalace do dvoušroubovice
A B C
NH
3
+
NH
3
+
A. ELEKTROSTATICKÁ INTERAKCE
- externí interakce podél dvoušroubovic
- příčinou jsou elektrostatické síly
Příklady:
Ionty Na+, Mg2+,
Nebo látky typu: + +
NN
B. VAZBA DO ŽLÁBKU (GROOVE-BINDING INTERACTION)
-přímá interakce molekuly s na hranách párů bází malého nebo
velkého žlábku
H
N
O
N
NH2
NH2
NH2
NH2
H
N
O
CH3
CH3
H
O
N
N N
H
+
+
Netropsin
Distamycin
Hoechst 33258
SN 6999
Cloroquine
C. INTERKALÁTORY
-planární aromatické struktury, které se vmezeřují mezi páry bází NK
- obecně jsou favorizovány G.C páry
NH2
N NH2
Proflavine
+
NH2
NH2
R
N
R = -C2
H5
ethidium
Br
R = -(CH2
)3
N+MeEt2
propidium
Ethidium bromid
+
CH3
CH3
CH3
CH3
S
N
N N
Methylene blue (MB)
OH
O OH
OH
O
O
COCH3
CH3
O
O
CH3
NH2
OH
Daunomycin
Co
3+
N N
N
N
N
N
Co(phen)3
3+
N N
N
N N
N
Ru
2+
Ru(bipy)3
2+
C.1 BIS- INTERKALÁTORY
- dva planární aromatické struktury, které se vmezeřují mezi páry bází NK
- obecně jsou favorizovány G.C páry
- délka spojovacího linkeru určuje vzdálenost vazby
- přírodní bis-interkalátory – chinoxalinová protinádorová antibiotika
N
H
NH
(CH2)n
+ +N
H
N H
Acridine bisintercalator
QQ
ECHINOMYCIN TRIOSTIN A
CHINOXALINOVÁ ANTIBIOTIKA
CH
S
CH2
SCH3
CH2
S
S
CH2
Echinomycin
O
N
N
O
CNC
O
C
N
CH3
CC
CH3
N
O
O
C
CH3
N
CH3CH3
C
C
O
C
C
C
N
N
O
C N C
O
C
N
CH3
C C
CH3
N C
O
N
C
CH2
CH3
S
C
CH3
N
CH3
CH3
C
C
O
C
C
10-11 A
ssDNA, dsDNA - echinomycin
ss DNA + Echi
-1,0E-06
-7,0E-07
-4,0E-07
-1,0E-07
2,0E-07
-1,7 -1,4 -1,1 -0,8 -0,5 -0,2
E/ V
I/A
ds DNA + Echi
-1,0E-06
-7,0E-07
-4,0E-07
-1,0E-07
2,0E-07
-1,7 -1,4 -1,1 -0,8 -0,5 -0,2
E/ V
I/A
G
AC
-1.0E-07
0.0E+00
-0.7 -0.6 -0.5
I/A
-1.0E-07
0.0E+00
-0.7 -0.6 -0.5
I/A
N
N
R
O
O
CH3
OsO4
R
CH3
OH
NH
N
OH
O
O
a
N
N
R
O
O
CH3
b
Os, bipy
R
CH3
H
O
Os
ONH
N
O
O
2
4
3
N
N
SO3
-
CH3
CH3 N
N CH3
CH3
1
N N
SO3
-
N
N
N
O N
O
H
H
H
H
A
B
tetramethylethylenediamine
(temed)
bathophenanthroline disulfonic acid
(bpds)
bipyridine phenanthroline
Osmium oxide-bipyridin adukt
N
N
N
H H
O
H
4 5
6
1
2
3
Os,bipy
N
H H
O
H
O
Os
N
N
O
O
O
N
N N
N
a b
Fe
O
H Fe
O
CH3
Fe
OH
H
H
Fe
OH
H
CH3
Fe
O
C H COOH6 4
CH CHFe
O
2 2
Fe
NOH
CH2
CH CH COOH
Fe
O
2 2
Fe
O
OH
DERIVÁTY FEROCENU
Scheme 1
ANNE et al., JACS 2003, 125, 1112
ANNE et al., JACS 2003, 125, 1112
ANNE et al., JACS 2003, 125, 1112 beacon
FAN et al., JACS 2003, 100, 9134
Scheme 1. Electrochemical Detection of Target Nucleic Acid
Sequences
Using a DNA Wrap Assay as Opposed to a Conventional
Sandwich Assay
Immoos, C.E., Lee, S-J., Grinstaff, M.W., JACS 216 (2004) 10814-5
Figure 1 Cyclic voltammograms of 5'-Fc-DNA-PEG-DNASH-3'
modified gold ball electrodes in the absence (red)
and presence (black) of target DNA (200 nM).
(Conditions: 100 mV/s, 25 mM phosphate buffer, 100
mM NaCl, pH 7.0).
A Nanocarbon Film Electrode as a Platform for Exploring DNA Methylation
Dai Kato,†,^ Naoyuki Sekioka,†,‡ Akio Ueda,†,§ Ryoji Kurita,† Shigeru Hirono,jj Koji Suzuki,#,^
and Osamu Niwa* J. AM. CHEM. SOC. 9 VOL. 130, NO. 12, 2008 3717
A Nanocarbon Film Electrode as a Platform for Exploring DNA Methylation
Dai Kato,†,^ Naoyuki Sekioka,†,‡ Akio Ueda,†,§ Ryoji Kurita,† Shigeru Hirono,jj Koji Suzuki,#,^
and Osamu Niwa* J. AM. CHEM. SOC. 9 VOL. 130, NO. 12, 2008 3717
2’-O-(o-carboran-1-yl)methyloligonucleotides
2’-CBM-oligonucleotide).
BNCT nádorů
A Number of bases
ODN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 13 14 15 16 17 18
T 5'-(A)25 A A A A C G G C G A T C T A G T G C - 3'
RP-3 5'- G C A C T A G A T C G C C G T T T T - 3'
RP-4 5'- G C A C T A G A T C G C C G T U-L1 U-L1 T - 3'
RP-5 5'- G C A C T A C T T C G C C G T U-L1 U-L1 T - 3' 2-MM
RP-6 5'- C C G C G G A C A T C G T G C U-L1 U-L1 T - 3'
RP-7 5'- L2-G C A C T A G A T C G C C G T T T T - 3'
B Number of bases
ODN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 13 14 15 16 17 18
T1 5'- G C A C T A C T T C G C C G T U-L1 U-L1 T - 3'
CP1 5´-biot A A A A C G G C G A A G T A G T G C - 3'
CP2 5´-biot A A A A C G G C G T A G T A G T G C - 3' 1-MM
CP3 5´-biot A A A A C G G C C T A G T A G T G C - 3' 2-MM
0.0 0.4 0.8 1.2
0.5 A
E / V
I / A
a
b
c
0.0 0.4 0.8 1.2
0.5 A
E / V
I / A
a
b
c
0.5 A
E / V
I / A
a
b
c
3
7
4
0.0 0.4 0.8 1.2
0.5 A
E / V
I / A
a
b
c
0.0 0.4 0.8 1.2
0.5 A
E / V
I / A
a
b
c
0.5 A
E / V
I / A
a
b
c
3
7
4
0.0 0.4 0.8 1.2
0.5 A
E / V
I / A
a
b
c
0.0 0.4 0.8 1.2
0.5 A
E / V
I / A
a
b
c
0.5 A
E / V
I / A
a
b
c
3
7
4
-biotin-AAAACGGCGAAGTAGTGC (CP1)STV
-biotin-AAAACGGCGAAGTAGTGC (CP1)
TUUTGCCGCTTCATCACG (T1)
STV
STV
-biotin-
-biotin-
STV










H 









H
.....TTTTTTTTTTTUUTGCCGCTAGATCACG
DB
DB
DB
DB
DB










H 









H










H 









H
.....TTTTTTTTTTT
.....TTTTTTTTTTT
.....AAAAAAAAAAAAACGGCGATCTAGTGC
.....AAAAAAAAAAAAACGGCGATCTAGTGC
.....TTTTTTTTTTT
.....AAAAAAAAAAAAAGCACGATGTCCGCGG
TUUTGCCGCTAGATCACG










H 









H
complementary
non-complementary
A
B
(CP)
(T)
(RP)
0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1
-6-0.01x10
-60.02x10
-6
0.04x10
-60.07x10
-6
0.09x10
-6
0.12x10
E / V
I/A
Peak of (1) (Ep=0.56 V)
B
0
20
40
60
80
100
%
0
20
40
60
80
100
e T RP-3 RP-4 RP-5 RP-6
Peak of G (Ep= 0.94 V)
40 nA
peak G
RP-4
A
C
e T RP-3 RP-4 RP-5 RP-6
RP-6
peak (1)
B
CP1
CP2
CP3
A
B
C
5
3
1
2
6 7
8
4 9
purine
-elektroanalytické vlastnosti (kvantitativní analýza)
-elektrochemické vlastnosti (redox mechanismy, adsorpce)
-druhy elektrod
Elving, Dryhurst, Janík, Zuman, Paleček, Goyal, Czochralska,
Nurnberg, Malfoy, Sequaris, Vetterl, Retter, Brabec, DeLevie
Wang, Florence, Sawamoto, Brett, Trnková……
Elektrochemie purinových derivátů
NH2
N
N
N
N
H
adenine
O
H2N N
NH
N
H
N
NH2
N
NN
N
H
+2H++2e-
NH2
N
NN
N
H
H
H
2H+ + 2e+
NH2
N
NN
N
H
H
H
H
H
H
N
NN
N
H
C H
H N2
C
O
N
NH
N
N
O
OH OH
HOCH2
H2
N
guanosine
7,8-dihydroguanosine
9-ribosyl-2-aminopurine
N
NN
N
H
C H
O
H
H N2
C
H
H
REDUKCE
N
NO
H
NH2
+ 2H+ + 2e
- N
NO
H
NH2H H
-NH3
N
NO
H
+ H+ + e- 1
2
N
N
H
H
O
H 2
C -CYTOSIN
G -GUANINE
OXIDACE
Xanthine oxidation
NH2
OH OH
N
N
N
O
N
OO PPOPO
NH2
OH OH
N
N
N
O
N
OO PPO
NH2
OH OH
N
N
N
O
N
OO P
NH2
OH OH
HOCH2
N
N
N
O
N
OH OH
HOCH2
N
N
N
O
N
OH
N
N
N
N
H
OH
N
N
N
O
O N
H
O
N
N N
N
H
H
H
H
O
O
N
H
NH
O
N
H
O
O
NH2
Deficit hypoxanthin-fosforibosyltransferázy (HPRT), částečný = Kelley-Seegmillerův syndrom, kompletní=
Lesch-Nyhanův syndrom
Deficit adeninfosforibosyltransferázy (APRT), 2,8 - dihydroxyadeninová litiáza
Deficit xanthinoxidázy (XOD), dědičná xanthinurie
Deficit adenosindeaminázy (ADA)
Zvýšená aktivita adenosindeaminázy (ADA)
Deficit purinnukleosidfosforylázy (PNP)
Deficit myoadenyládeaminázy (M-AMPDA)
Deficit adenylosukcinátlyázy (ASase)
Deficit molybdenového kofaktoru – deficit sulfitoxidázy SO, xanthinoxidázy XOD
Familiární juvenilní hyperurikemická nefropatie (FJHN)
Zvýšená aktivita fosforibosyldifosfátsynthetázy (PRPPs)
Primární dna
Dědičná renální hypourikémie
Deficit inosintrifosfát pyrofosfohydrolázy (ITP)
s Cu (II)
bez Cu (II)
el
DPV, CPE
0,20 0,45 0,70 0,95 1,10E / V
5 A
N N H
NH
O
N
H
hypoxantins Cu (II)
bez Cu (II)
el
s Cu (II)
el
DPV, CPE
0,20 0,45 0,70 0,95 1,10E / V
5 A
N N
NH
O
N
H
hypoxantin
0,20 0,45 0,70 0,95 1,10E / V0,20 0,45 0,70 0,95 1,10E / V
5 A
N
NH
O
N
H
hypoxantin
5 A
N N H
NH
O
N
H
O
xantin
0,20 0,45 0,70 0,95 1,10E / V
el
bez Cu (II)
s Cu (II)
DPV, CPE
5 A
N N H
NH
O
N
H
O
xantin
0,20 0,45 0,70 0,95 1,10E / V
el
bez Cu (II)
s Cu (II)
DPV, CPE
5 A
N N H
NH
O
N
H
O
xantin
0,20 0,45 0,70 0,95 1,10E / V
5 A
N N H
NH
O
N
H
O
xantin
5 A
N N
NH
O
N
H
O
xantin
5 A
N
NH
O
N
H
O
xantin
0,20 0,45 0,70 0,95 1,10E / V0,20 0,45 0,70 0,95 1,10E / V
el
DPV, CPE
N
H
NH
O
N
H
O
O
NH2
allantoin
N N
H
NH
O
N
allopurinol
N N
H
NH
O
N
O
oxypurinol
NH
N N
N
O
H
hypoxanthine
N N
N
O
HO
HN
xanthine
N
N N
N
O
HH
H
O
O
H
2,6,8 - trihydroxypurin
Potraviny Obsah purinů
(mg/100g)
Potraviny Obsah purinů
(mg/100g)
Maso, uzeniny Celozrnný chléb 14
Hovězí 40 Bílé pečivo 8
Telecí 40 Ovesné vločky 30
Vepřové 48 Brambory, luštěniny, zelenina
Skopové 46 Brambory 6
Kuřecí 40 Čočka 70
Králičí 38 Hrách 45
Zvěřina 35-39 Fazole 44
Šunka 24 Celer 10
Anglická slanina 25 Cibule 1
Vnitřnosti Fazolové lusky 5
Játra 95 Zelený hrášek 80
Ledvinky 80 Chřest 14
Jazyk 55 Kapusta 6
Telecí brzlík 400 Kedlubny 5
Ryby Květák 10
Kapr 54 Mrkev 2
Losos 22 Okurky 3
Pstruh 56 Pór 3
Sardinky 120 Rajčata 4
Sleď 69 Reveň 4
Štika 48 Ředkvičky 6
Mléko, vejce Řepa červená 5
Mléko 1 Salát hlávkový 5
Vejce 2 Špenát 23
Bílek 1 Zelí bílé 5
Žloutek 5 Zelí červené 8
Tuky, ořechy, kakao Houby 5
Kakaový prášek 1900 Ovoce
Mandle 9 Borůvky 2
Lískové ořechy 10 Hrušky 1
Vlašské ořechy 8 Jablka 1
ANALÝZA BÁZÍ V PŘÍTOMNOSTI Cu(II)
Je-li Cu(II) redukována na Cu(I) v přítomnosti purinových bází jako je
adenin nebo guanin, Cu(I) reaguje s těmito bázemi a tvoří komplexy,
které se akumulují na povrchu rtuťové nebo uhlíkové elektrody.
Cu(I) v komplexu se může redukovat na Cu(0) za použití katodické
rozpouštěcí voltametrie a rtuťové elektrody, nebo oxidovat na Cu(II) za
použití anodické rozpouštěcí voltametrie a uhlíkové elektrody.
V obou případech výška voltametrického signálu je závislá na množství
purinových bází v roztoku, koncentraci Cu (II), akumulačním potenciálu a
době akumulace.
NEHYDROLYZOVANÉBÁZEA NUKLEOZIDY
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-E/ V
-I/nA
CYTIDIN
ADENIN
THYMIN
CYTOSIN
ADENOSIN
200nA
A
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-E/ V
-I/nA
ADENIN
GUANOSIN
CYTOSIN
ADENOSIN
B
HYDROLYZOVANÉ BÁZE A NUKLEOZIDY
0
2
4
6
8
10
0.0 0.4 0.8 1.2
Ele
Ade
Ade+Cu
E / V
I/A
0
2
4
6
8
10
0.0 0.4 0.8 1.2
Ele
Xan
Xan+Cu
I/A
E / V
Cu(II) + e => Cu(I) (at a deposition potential of -0.15 V)
Cu(I) + purine => [Cu(I)-purine] (in the reaction layer on PeGE surface)
[Cu(I)-purine] => [Cu(I)-purine] ads (adsorption of the complex)
[Cu(I)-purine]ads=>[Cu(II)-purine]ads+e(oxidative stripping, peak OxCom)
[Cu(II)-purine]ads => purineox+Cu(II)+e (oxidative stripping, peak Ox).
HYDROLÝZA DNA, OLIGONUKLEOTIDŮ, NUKLEOTIDŮ A NUKLEOSIDŮ
0
4
8
12
16
20
40 50 60 70 80 90 100
TEPLOTA / °C
-I/nA
Hydrolýza DNA, oligonukleotidů a nukleozidů se provádí přidáním 20 l of
1 M kyseliny chloristé ke stejnému objemu těchto látek, jejichž
koncentrace byla 4 M ( vztaženo na monomerní jednotku) a zahřátím na
75 °C po dobu 30 min. Po vychlazení, jsou vzorky neutralizovány NaOH a
přídavky smíchány se základním elektrolytem a provedeno voltametrické
měření. Závislost voltametrického signálu na teplotě je ukázána níže.
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
N
N
N N
NN
N
N
N
N
N
N
N
N
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
Sugar
P
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N N
NN
N N
NN
N N
NN
N N
NN
N N
NN
N N
NN
HYDROLYSIS
N N
NN
N N
NN
N N
NN
N N
NN
N N
NN
N N
NN
Deriváty PUR
N
N
N
N
H
NH2
6-amino-purine
H
NH2
NH2
N
N
N
N
2,6- diamino-purine
H
NH2
N
N
N
N
2-amino-purine
peak OxCom
peak Ox
Ade
2-AP
2,6-DAP
N
N
N
O
O N
H
xanthine
N
N
N
O
O
H
CH3
N
H
1-methylxanthine
N
N
N
O
O
CH3
H
N
H
3-methylxanthine
N
N
N
O
O
CH3
H
N
H
8-methylxanthine 9-methylxanthine
N
N
N
O
O
H
H
N
CH3
CH3
CH3
N
N
N
O
O N
H
CH3
CH3
N
N
N
O
O N
HCH3
caffeine
Paraxanthine
(1,7-dimethylxanthine)
ΔG = -RT ln Kt
ΔG = -nF E
U nukleobazí je běžná prototropní
tautomerie typu keto - enol a amin - imin
0
~31 kJ/mol
~ 35 kJ/mol
~ 52 kJ/mol
ADENIN
GUANIN
BÁZE POLOHA pKa
ADENIN N1 4.1
N9 9.8
HYPOXANTIN N7 1.9
N1 8.8
GUANIN N7 3.3
N1 9.4
Protonace vs deprotonace