NMR  Proteínov   Jozef  Hritz,  hritz@ceitec.muni.cz   Študijný  materiál:   hAp://www.ncbr.muni.cz/~lzidek/C9530/nuklearni_magneOcka_rezonance.pdf   PrakOcké  aspekty  NMR  proteínov   •  Potrebné  značné  množstvo  protéinu  v  opOmálnej   koncentrácii  >  1mM.  V  mnohých  prípadoch   potrebné  izotopické  značenie   •  Poskytuje  informáciu  o  jednotlivých   aminokyselinách/atómoch   •  Určenie  3D  štrukúry  je  časovo  aj  finančne   rela^vne  náročné   •   NMR  umožnuje  dať  aj  čiastočnejšiu  odpoveď   použi^m  jednoduchších/rýchlejších  experimentov         1D  1H  NMR  spektrum  ubiqui^nu   U  denaturovaného  ubiqui^nu  sú   peaky  širšie  a  v  oblasO  amidických   vodíkov  sú  rozprestrené  v  podstatne   užšej  oblasO  ako  je  tomu  u  zbaleného   ubiqui^nu  (~6-­‐10  ppm)     Použiteľnosť  ako  pre  izotopicky  značené,   tak  aj  neznačené  vzorky  proteínov   2D  1H,  15N  korelačné  NMR  spektra   (HSQC)   •  Je  potrebná  15N  izotopicky  značená  vzorka   •  OproO  1D  1H  spektru  omnoho  vyššie                rozlíšenie,  jeden  peak  zodpovedá  jednej              amidickej  skupine.     •  Častokrát  označované  aj  ako  proteín                “finger-­‐print”  experiment     CharakterisOcké  HSQC  pre  zbalený  a   rozbalený  proteín   Rozbalený                                                  Zbalený  proteín   Hlavné  rozdiely  v  disperzii  a     šírke  peakov   Problémy  NMR  väčších  proteínov   U  väčších  proteínov  zvačšujúca  sa  šírka  peakov  z  dôvodu  väčšieho  rotačného  korelačného  času   Väčšia  šírka  peakov  spolu  s  ich  vyšším  počtom  vedie  k  prekryvu  peakov  a  problémom  s  ich     rozlíšením.     Vplyv  vyššieho  magneOckého  poľa     na  rozlíšenie  spektra   Trosy  HSQC   3D  NMR  spektroskopia   Príklad  zvýšeného  rozlíšenia  na  3D  HNCA  NMR  experimente     Priradenie  peakov  v  HSQC  jednotlivým   aminokyselinám  pomocou  HNCA   V  HNCA  experimente  sú  korelované   chemické  posuny  1HN,    15N,    13Cα i  a  13Cα i-­‐1     Priradenie  peakov  v  HSQC  jednotlivým   aminokyselinám  pomocou  HNCA   Pri  väčších  proteínoch  problém  s  rozlíšením   silnejších  a  slabších  signálov,  prekryv  ….     Priradenie  kostry  väčších  proteínov     Veľké  Puzzle   Sekvenčné  priradenie   Predikcia  sekundárnej  štruktúry   Cα,  Cβb  a  CO  chemické  posuny  rela^vne     k  hodnotám  pre  náhodný  reťazec  majú   výraznú  koreláciu  s  torznými  uhlami     kostry  proteínu  ϕ  a  ψ.       Wishart,  D.S.  and  B.D.  Sykes.  The  13C  chemical     shi{  index.  A  simple  method  for  the  idenOficaOon    of  protein  secondary  structure  using  13C  chemical shi{  data.  J.  Biomol.  NMR  4:171-­‐180  (1994)   Efekt  mutácie   Titračné  merania   1H-­‐15N  HSQC  Otrácia  v  režime  rýchlej   výmeny   Možnosť  sledovať  viazanie     ligandu  simultánne  do  viacerých   väzobných  miest   Byeon  I-­‐J.  ,  Ahn  J.,  Mitra  M.,  Byeon  C-­‐H.,  Hercík  K.,  Hritz  J.,  Charlton  L.,  Levin  J.,     Gronenborn  A.M.  NMR  structure  of  human  restricOon  factor  APOBEC3A  reveals   substrate  binding  and  enzyme  specificity.  Nature  Commun.  2013,  4,  1890     NMR  Otrácie  ako  nástroj  pre  filtrovanie   súboru  väzobných  konformacií  ligandu   generovaného  molekulovým  dokovaním   H/D  výmena   No  D2O   1st  HSQC  a{er  D2O   t  =  60  min   Po  výmene  H  za  D  mizne  signál  v  HSQC.  Umožňuje  to     určiť  povrchové  verzus  vnorené  reziduá,  ktoré  sa  len     zriedkavo  dostávajú  do  kontaktu  s  D2O,  kde  by  mohlo     dôjsť  k  výmene.     Pozor:  Proteíny  sú  flexibilné!   NOE  distance  1   NOE  distance  2   NOE~r-­‐6