SAXS Small angle X-ray scattering - rozptyl rentgenového zaření v malých úhlech detektor X-ray crystallography 2θ=15-30 SAXSX-ray crystallography 2θ=0.1-92θ=15-30 SAXSX-ray crystallography SAXS Vzorek - pevná látka, tekutiny, vrtsvy - koloidní roztoky - částečně uspořádané systémy Informace - velikost a tvar částic, distribuce pórů, Aplikace - kovy, plasty, oleje, nanočástice - potraviny, farmaceutický průmysl Vzorek: protein, nukleové kys., komplexy v roztoku 1. Obecné strukturní parametry 2. Tvar částic 3. Homogenní vs. agregovaný vzorek 4. Složený vs. nesložený protein 5. Oligomerizace, interakce, kvarterní struktura 6. Modelování molekulární flexibility Biologické aplikace Vzorek: koloidní roztok nanočástic 1. Obecné strukturní parametry 2. Tvar částic 3. Homogenní vs. agregovaný vzorek 4. Distribuce velikostí (polydisperzní vzorky) 5. Core-shell struktura 6. Distribuce a velikost pórů Nanočásticové aplikace SAXS - výhody 1. snadná příprava vzorku 2. sleduje chování molekul v roztoku 3. užitečný před i po vyřešení molekulární struktury 4. rychlost experimentu 5. není limitován velikostí molekul SAXS - nevýhody 1. rozlišení ~10-20Å 2. nejednoznačná interpretace 3. neexistuje Rfaktor Rozlišení SAXS modelů 1. Braggovo qmin = 0.006Å-1 ~ d = 1000Å qmax = 0.6Å-1 ~ d = 10Å 2. Efektivní “low resolution structure” ~ bez číselné hodnoty odpovídá mapě el. hustoty s rozlišením cca 20Å Rozlišení 5Å 10Å 15Å 20Å SAXS 10-20Å RTT complex ~7000atoms 50Å Odečtení příspěvku solventu SAXS strukturní informace Ø q [Å-1 ] intenzitadetektor Fourier Transform Guinier plot Analýza rozptylové křivky ve velmi malých úhlech 1. Odchylky od linearity – agregace (nepříznivě ovlivňuje sběr a interpretaci dat) 2. Poloměr gyrace Kratky plot Kompaktnost molekuly Pair distribution function dmax =10nm SAXS modelování tvaru Program DAMMIN SAXS experiment-synchrotron SAXS experiment-domácí zdroj Rotating Anode: MicroMax-007 HF Filament Anode ● 99mm diameter ● Cu-target ● 9000 RPM ● water-cooled ● Tungstem (W) ● 70μm focal spot Tube tower ● 2 X-ray ports ● 0.2mm Be windows ● integrated vacuum pump ● water-cooled Confocal Max-Flux Optics ● 2 perpendicular multilayers ● flux maximalization ● spectral purity ● spatial definition Kratky block ● pair of colimating blocks ● blocks are parallel and rotatable ● produce symetric beam ● detector in fixed position Sample Capilary ● Sample volume 15μL (30-40μL) ● Glass capilary in steel holder ● Manual handling Motorized Sample Holder 1 powder standard 3 sample positions temperature control -30 / +60°C Beamstop ● Photodiode beamstop ● Intensity measurements for: - Sample absorption correction - Sample possitioning - Kratky block alignment Pilatus 100K ● CMOS hybrid-pixel technology ● Single-photon-counting mode ● Pixel size 172 x 172 [µm2 ] ● Counting rate per pixel 2 x 106 [photons/s] ● Area 83.8 x 33.5 [mm2 ] Direct beam Direct beam image from BioSAXS-1000, aqusition time 3s SAXSLab2.0.1b2 Odečtení příspěvku solventu SAXS experiment-Guinierova analýza Program PRIMUS aproximace I(0), Rg , agregace SAXS experiment-Guinierova analýza aproximace I(0), Rg , agregace SAXS experiment-Kratkého analýza Program PRIMUS - Folding, Porodův objem SAXS experiment - P(r) Program GNOM - Tvar, dmax SAXS modelování tvaru ab initio I(q) q [Å-1 ] test shody: SAXS modelování tvaru Program DAMMIN SAXS modelování tvaru Chain-like GASBOR model složen z univerzálních residuí (Dummy residues) s průměrnou el. hustotou a rozestupy ~0.38 nm Pozice středu kuliček odpovídá Cα Počet kuliček odpovídá počtu aminokyselin v proteinu Program GASBOR SAXS modelování tvaru Program GASBOR Program DAMMIN Srovnání GASBOR vs. DAMMIN SAXS experiment - envelope 10Å Rigid-body modeling ● Jsou známy X-ray struktury podjednotek ● Není známa kvartérní struktura ● Automatické hledání ● Interaktivní hledání ● Doplňování chybějících komponent (ab initio ) ASSA: manual refinement Rigid-body modeling MASSHA: automatic refinement SAXS experiment - CRYSOL teoretický rozptyl vs. experimentální data oligomerní stav v roztoku při znalosti krystalové struktury SAXS experiment - CRYSOL teoretický rozptyl vs. experimentální data vyhodnocení výsledků dockingu Molekulární flexibilita ● vibrace [fs] ● rotamery bočních řetězců [ps] ● ohýbání β-řetězců a α-helixů [zlomky ns] ● rotace molekul v roztoku [ns] ● pohyby domén [ns] Flexiblilní systémy Flexiblilní systémy Flexiblilní systémy EOM - kombinace rigid body + ab initio modelingu 18% 11% 10% 5% Oligomerní stav v roztoku OLIGOMER - lineární kombinace teor. profilů c=2.6mg/ml c=0.9mg/ml Teoretické informace pro uživatele ● obecné strukturní parametry ● homogenní vs. agregovaný vzorek ● složený vs. nesložený protein/DNA ● oligomerní stav v roztoku ● kvartérní struktura a interakce ● SAXS struktura s nízkým rozlišením ● Sample volume: 15μL (30μL); pure and monodisperse :) ● Exposure time: 40min per sample (q=0.008; c>1mg/ml) ●qrange : 0.008(0.005) - 0.65 Å-1 ; drange = 785/(1231) - 10 (20)Å ● Reservation system: http://www.sci.muni.cz/~necas/new/index_saxs.html ● Local contact: klumpler@sci.muni.cz marek@chemi.muni.cz Praktické informace pro uživatele Závěr ● Jak se provádí SAXS experiment a co je měřeno? ● Jak veliké částice lze pozorovat SAXS? ● Jaké informace o vzorku lze zjistit nepřímo?