GLP/SLP v biologii – základy QA/QC Přehled aplikací a postupů vyžadujících GLP * příkladová SOP * příkladová studie Vybraná témata detailněji: * Léčiva a jejich regulace * Zajištění zdraví člověka Principy řízení a kontroly rizikových faktorů Bezpečnost látek – regulace (REACH) Laboratorní a pokusná zvířata Bezpečnost látek - toxikologické studie Bezpečnost látek - alternativní testovací systémy * Zajištění bezpečnosti pro životním prostředí Ekotoxikologie GMO GLP v biologii – přehled (Luděk Bláha, RECETOX PřF MU) Co vyžaduje SLP ? …zákony http://www.mvcr.cz/ GLP v biologii - úvod •BIOLOGIE = Experimentální věda a Praktická biologie/biochemie/mikrobiologie atd. • •Nutnost dodržovat GLP zejména,když výsledky jsou využity při rozhodování • •= Praktická biologie a biochemie –Léčiva (registrace/povolení, výroba, kontrola, přípravy…) –Lékařská biologie a biochemie –Mikrobiologická kvalita (potraviny, pitná voda) –Průmyslové chemické látky, potravní aditiva, potenciálně nebezpečné agens (geneticky modifikované organismy) .. a jejich bezpečnost = toxikologie, ekotoxikologie, biodegradabilita, –Další zákonem dané oblasti ve vztahu k biologii – dodržení etických požadavků (např. práce se zvířaty/obratlovci) GLP v biologii – základní principy a příkladová STUDIE •V Biologii platí stejné principy jako pro chemické analýzy (viz předchozí přednášky – QA/QC, detailní SOPs, dokumentace …) • •Příklad - „jednoduché“ STUDIE v režimu GLP • à à à à (viz ukázka) Příkladová STUDIE (ukázka) •Cíl studie: •Podkladový materiál pro registraci (povolení) využití aspirinu u prasat •Jeden z dílčích podkladových materiálů - popis farmakokinetiky aspirinu u prasat po jednorázovém podání (příklad) • •Experimentální design: •8 zvířat (prasat), jednorázová aplikace aspirinu •odběry krve v definovaných časech (0-144 h) •sledování hladin metabolitů K. AcSal a vyhodnocení •Realizace: •1) Plán projektu (100 stran + přílohy SOPs) •2) Výstup – Zpráva z realizace (detailní dokumentace vč. Veškerých odchylek) •Přímá – jmenovitá – odpovědnost konkrétních osob … atd. • Standardní operační postup příklad •Ukázka SOP – ELISA stanovení toxinu microcystinu • à viz příklad ve studijních materiálech Příklad: V laboratoři SZÚ musí pravidelně vyšetřovat obsah těžkých kovů v černém čaji. Připravte SOP pro přípravu černého čaje, ve kterém bude následně analyzovány těžké kovy •Struktura SOP –Název –Autor –Určení a cíl –Princip –Rušivé vlivy a omezení metody –Bezpečnost při práci a toxikologické údaje –Odpady a jejich likvidace –Normativní odkazy –Chemikálie a spotřební materiál –Vzorky –Přístroje –Kalibrace před zkouškou –Vlastní postup –Kontrola kvality –Výstup – protokol / výpočet –Poznámky doplňky • GLP v biologii 1 – Léčiva GLP v biologii 1 – Léčiva •GLP & přesná dokumentace vyžadována u humánních i veterinárních léčiv: –Registrace před použitím •průkaz a dokumentace farmakokinetiky, cílové aktivity ve srovnání s existujícími postupy, bezpečnost pro lidi + nově i pro životní prostředí … –Dokumentace celého životního cyklu - výroba, přípravy v lékárnách, kontrola kvality, aplikace, reporting vedlejších účinků, likvidace (nebezpečný odpad) –Státní autority: •SÚKL (Státní úřad pro kontrolu léčiv) •ÚSKVBL (Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv) –EU: Evropská léková agentura (EMA) –USA: Food and Drug Administration (FDA) www.uskvbl.cz Vývoj nových léčiv Vývoj nových léčiv Internet Pfizer GLP v biologii 1 – Léčiva •Základní zákonný dokument: •Zákon o léčivech č. 378/2007 •A příslušné prováděcí vyhlášky –(viz příklad: ke zkoušce znát vnitřní strukturu a základní obsah) • • •Pro informaci: další zákony v kompetenci SÚKL –Zákon č. 167/1998 Sb., o návykových látkách a o změně některých dalších zákonů, ve znění pozdějších předpisů –Zákon č. 160/1992 Sb., o zdravotní péči v nestátních zdravotnických zařízeních • • Prováděcí předpisy k zák. 378/2007 •vyhláška č. 229/2008 Sb., o výrobě a distribuci léčiv, ve znění pozdějších předpisů •vyhláška č. 228/2008 Sb., o registraci léčivých přípravků, ve znění pozdějších předpisů •vyhláška č. 106/2008 Sb., o správné praxi prodejců vyhrazených léčivých přípravků a o odborném kurzu prodejců vyhrazených léčivých přípravků •vyhláška č. 226/2008 Sb., o správné klinické praxi a bližších podmínkách klinického hodnocení léčivých přípravků, ve znění pozdějších předpisů •vyhláška č. 54/2008 Sb., o způsobu předepisování léčivých přípravků, údajích uváděných na lékařském předpisu a o pravidlech používání lékařských předpisů, ve znění pozdějších předpisů •vyhláška č. 84/2008 Sb., o správné lékárenské praxi, bližších podmínkách zacházení s léčivy v lékárnách, zdravotnických zařízeních a u dalších provozovatelů a zařízení vydávajících léčivé přípravky, ve znění pozdějších předpisů •vyhláška č. 85/2008 Sb., o stanovení seznamu léčivých látek a pomocných látek, které lze použít pro přípravu léčivých přípravků, ve znění pozdějších předpisů •vyhláška č. 86/2008 Sb., o stanovení zásad správné laboratorní praxe v oblasti léčiv, ve znění pozdějších předpisů •vyhláška č. 143/ 2008 Sb., o stanovení bližších požadavků pro zajištění jakosti a bezpečnosti lidské krve a jejích složek (vyhláška o lidské krvi), ve znění pozdějších předpisů GLP 2 Zdraví člověka – principy, regulace GLP v biologii 2 – zdraví člověka •Zdraví člověka ovlivňuje řada faktorů, jejichž KVALITA musí být kontrolována (státem) a GLP hraje významnou roli: – - preklinické studie léčiv (viz dříve) – - potraviny, pitná voda, rekreační voda, vnější ovzduší, pracovní ovzduší, hlučnost … (+léčiva) – - zdravotní péče (vyšetření, analýzy … správná klinická praxe) • •Autority dohlížející na kvalitu = Ministerstva (MZe, MZd, MŽP) a zřizované ústavy (kompetence předmětem diskuze) –Dozorující a výkonná funkce •Hygienické stanice •Státní zemědělská a potravinářská inspekce •Státní veterinární správa – –Další funkce (např. poradní, analýzy …) •Státní zdravotní ústav •Zdravotní ústavy (zpr. krajské) •Státní veterinární ústav www.mzcr.cz Krajské hygienické stanice (www.khsbrno.cz) www.szpi.gov.cz www.szu.cz Zdravotní ústavy (příspěvkové organizace) – např. www.zubrno.cz Státní veterinární správa à krajské veterinární správy (dozorující orgány jako KHS) Státní veterinární ústav (příspěvková organizace MZe) GLP v biologii 2 – zdraví člověka •Pro každou kategorii, tj.: –Potraviny, Pitná voda, Rekreační voda, Ovzduší –Zdravotní péče •… jsou definovány různé a specifické požadavky na kvalitu •Chemické rozbory - limity pro vybrané toxické látky (různé druhy potravin, různé limity): toxické kovy – př. Hg, toxiny plísní, persistentní látky (polychlorované bifenyly, dioxiny), pesticidy, nepovolené náhražky •Mikrobiologická bezpečnost - kultivace nebo jiný průkaz patogenů (např. metody molekulární biologie – Listerie v potravinách; sterilita léčiv podávaných intravenózně atd.) •Další specifické požadavky (prašnost – např. limity pro PM10 = particulate matter >10micrometrů; limity pro hlučnost …) •Lékařská vyšetření a analýzy - např. průkaz rakovinných biomarkerů, biomarkery v těhotenství, přítomnost HIV … GLP v biologii 2 – zdraví člověka •Kdo sleduje (odpovídá za) kvalitu ? –výrobci (voda, potraviny…) + prodejci –zdroje znečištění (průmysl, čistírny odp. vod …) – •Odpověné osoby musí objednávat zkoušky/rozbory: –Zajištění rozborů (pokud jde o požadavek zákona) = akreditované laboratoře –Vlastní laboratoře přímo u výrobce –Soukromé laboratoře –Státní zdravotní ústav, Zdravotní ústavy, Veterinární ústavy … •Občan, NGO a další může také požadovat/objednat rozbory kvality – Příklad – limity - Nebezpečná vlastnost odpadu H13 •H13: Schopnost uvolňovat nebezpečné látky do životního prostředí při nebo po jejich odstranění –Tuto vlastnost mají odpady, které mohou jakýmkoliv způsobem uvolňovat nebo vést při nebo po svém odstranění ke vzniku škodlivých látek, které negativně působí na životní prostředí a zdraví lidí. •Jako nebezpečný odpad s touto nebezpečnou vlastností se hodnotí: –a) odpad, který uvolňuje do vodného výluhu škodliviny v množstvích překračujících hodnoty limitních koncentrací v e výluhu stanovených v tabulce č . 6.1 přílohy č. 6 a/nebo obsahuje vybrané škodliviny v množství překračujícím limitní koncentrace stanovené v tabulce č. 6.2 přílohy č. 6, –b) odpad, který uvolňuje do jakékoliv složky životního prostředí škodlivé látky v množství překračujícím limity stanovené zvláštními právními předpisy… Další příklad: Limity (Kritéria) Znečištění vod 1 Rámcová směrnice o vodě – příklady limitů (EQS) GLP 3 Bezpečnost chemických látek - úvod Jsou nebezpečné/toxické látky regulovány ? •Do nedávna –povinnost průmyslu prokazovat bezpečnost chemikálií velmi nepřehledná •Řada různých (často protichůdných) regulací •Současnost –EU = sjednocení – nová legislativa REACH –USA, Japonsko, Canada atd. – podobný vývoj – •Pro zvláštní případy stále existují specifické direktivy (např. pesticidy …) REACH - REGULACE chem. látek v EU •REACH = Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals REACH - REGULACE chem. látek v EU •Evropská unie - ECHA (European Chemical Agency) http://echa.europa.eu/ REACH - REGULACE chem. látek v EU INNITIAL ESTIMATED NUMBER OF PHASE-IN SUBSTANCES: 30,000 REGISTERED SUBSTANCES IN ECHA (data from 31st March 2011)1 : 2,452 [1 ECHA, Information on registred substances: http://apps.echa.europa.eu/registered/registered-sub.aspx REACH Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals •Všechny chemikálie vyráběné nebo dovážené do EU musí být registrovány, zhodnoceny (testovány) a autorizovány (náklady nese průmysl) •Hodnocení rizik – cca 30000 chemikálií –– harmonogram dle důležitosti (nejdříve HVP - High Volume Production chemicals > 1000 t/rok, postupně ostatní •Hodnocené parametry –Fyz.chem. vlastnosti + degradabilita, persistence –Toxicita pro člověka –Nebezpečnost pro prostředí = ekotoxicita •Definování látek s velkým významem REACH •Látky s velkým významem (nebezpečnosti) - Annex XIV –SVHC = Substances of Very High Concern •Toxický pro reprodukci a/nebo Karcinogenní a/nebo Mutagenní a/nebo PBT (Persistentní Bioakumulativní Toxický) a/nebo vPvB (velmi P velmi B) •à potenciální zákaz! Nesmí jít na trh a být užívány – –1) Candidate list: cca 50 látek (2011) – musí být zhodnoceny –http://echa.europa.eu/chem_data/authorisation_process/candidate_list_table_en.asp –2) ECHA doporučuje („recommendiation“) Evropské komisi zákaz vybraných látek REACH EU - předp. počty testovaných chemikálií REACH EU předpokládané náklady na testování GLP v biologii 4 Biologické modely (organismy) *Využití obratlovců * Alternativní metody GLP v biologii 3 – MODELY v biologii •Existuje mnoho přístupů v biologii (řada musí být využívána při hodnocení „bezpečnosti“ pro zdraví člověka – viz předchozí diskuze – léčiva, bezpečnost chemických látek …) • •Biologické modely: –Obratlovci •in vivo (zvířata) •ex vivo (orgány zvířat) •in vitro (buňky, buněčné linie) –Bezobratlí –Rostliny –Bakterie Význam využití zvířat (obratlovců, savců / pokusných zvířat) •Unikátní 3D prostorové uspořádání •Fyziologické a Farmako(Toxo)kinetické procesy (podobné s člověkem) •Lze pozorovat komplexní účinky (podobné s člověkem) •Mnoho látek má více mechanismů toxického efektu • •Z těchto a dalších důvodů - nutno provádět zkoušky in vivo –Účinnost léčiv (vč. Vedlejších účinků) – –Bezpečnost kosmetických přípravků –Toxicita chemických látek pro člověka LEGISLATIVA EU „REACH“ Užívání pokusných zvířat v EU (2008) reporting členských států (viz také studijní materiály) Využití zvířat (=obratlovců) – zvláštní případ (etické aspekty…) •Právní rámec – nutnost regulace –Zákon na ochranu zvířat proti týrání 246/1992 –Vyhláška 311/1997 (o využití pokusných zvířat) • •Odpovědný úřad –Ministerstvo zemědělství a jeho Ústřední komise pro ochranu zvířat www.eAGRI.cz (také www.mze.cz) Využití zvířat (=obratlovců) •Zákon 246/1992 a Vyhláška 311/1997 definují –CO je zvíře = jen OBRATLOVEC (kromě embryí a plodu) •typy zvířat: laboratorní / pokusné ... –KDO smí zvířata využívat •Vyžaduje se registrace ÚKOZ (MZe) •Etické komise jednotlivých pracovišť – –JAK lze experimenty realizovat (dodržování pravidel GLP) •Zdůvodnění využití zvířat (musí být schváleno etickou komisí) •projekt pokusu, protokol pokusu, evidence Zákon stanoví kdy lze pokusných zvířat využít –výroba, vývoj, kontrola kvality, nezávadnosti a účinnosti léčiv, biopreparátů, potravin a event. jiných výrobků –studium nemocí, prevence, diagnostika, léčení –studium fyziologických procesů –ochrana životního prostředí –výuka na SŠ a VŠ Zákon stanoví - kdy se zkoušení vyžaduje OCHRANA ČLOVĚKA a HOSP. ZVÍŘAT potraviny, zemědělské látky kontrola léčiv výroba léčiv - farmakologické preklinické studie farmakokinetika nežádoucí účinky toxicita (akutní, chronická) mutagenita, kancerogenita reprodukční toxicita GLP 5 Bezpečnost chemických látek pro člověka Testování toxicity in vivo Které látky jsou toxické ? •Každá látka je toxická, záleží jen na DÁVCE a DOBĚ PODÁNÍ (expozice) –Krátkodobá (akutní) expozice •-> akutní rychlé účinky (smrt) –Dlouhodobá (chronická) expozice •-> problematičtější efekty (nemoci, nádory, imunotoxicita, reprodukční toxicita …) • •Hodnocení a srovnání toxicity: –nejč. LD50 (letální dávka 50) – dávka, která s největší pravděpodobností způsobí smrt 50% exponovaných jedinců – (vyjádření jako koncentrace – např. mg/kg živé váhy) –další parametry „bezpečnosti“ – např. TDI –tolerovatelný denní příjem (např. mg/kg živé váhy/den) • AKUTNÍ TOXICITA intraperitoneální aplikace - potkan Nejčastější test - Přesné dávkování - Sledování letality a akutních projevů 24-48h - Méně relevantní expozice AKUTNÍ TOXICITA perorální podání – lab. zvíře:potkan CHRONICKÁ TOXICITA •Vyšetření méně specifických efektů při dlouhodobém (opakovaném) podávání • •Dávky pro testování se odvozují z akutní toxicity (nejvyšší koncentrace odpovídající LD50, dále 10x a 50x nižší) • •Délka studie závisí na „předpokládaném“ schématu podávání látky •př. Léčivo předpokládané podávání délka studie •1-2 d/wk 2 wks •1,2,3 ...7 d 4 wks •Opak 1-30 d 4 months •Opak > 30 d 6 months • •Složitý design a řada požadavků –Zvířata (více druhů, stáří, pohlaví…), počty ve skupině •Vyhodnocení - pitva (definované úkony), statistika … • •Ekonomická náročnost , etické problémy … GLP! • REPRODUKČNÍ TOXICITA •Zjišťuje se vliv na –sexuální chování zvířat –prenatální mortalitu –fetální abnormality & poškození během života – • Experimenty –změny fertility, vliv na F a M gamety (poměry narozených F a M); toxicita pro embrya a féty, změny gravidity ovlivňující fety, vliv na růst a vývoj dělohy a placenty, porod, postnatální vývoj a laktaci matky, vliv na potomstvo (schopnost učení) •Složitý design a náročné vyhodnocení –viz chronická toxicita HODNOCENÍ KARCINOGENITY •Mutagenní a genotoxické látky – zpravidla považovány za karcinogenní –Rakovina – velký problém pro západní civilizaci –Oproti jiným toxickým látkám - karcinogeny jsou považovány za „bezprahově působící“ •Neexistuje bezpečná dávka (i jedna molekula může vyvolat efekt) • •Experimentální průkaz karcinogenity – nejnáročnější studie (celoživotní expozice, stovky zvířat v experimentu …) –POZOR - ne vždy však existují korelace výsledků - zvíře vs. člověk (!) • •Řada klasifikačních schémat chemických látek –WHO (Světová zdravotnická organizace) –IARC - Intern. Agency for Research of Cancer • http://www.iarc.fr KLASIFIKACE IARC •Group 1: The agent (mixture) is carcinogenic to humans. • •Group 2 –Group 2A: The agent (mixture) is probably carcinogenic to humans. –Group 2B: The agent (mixture) is possibly carcinogenic to humans. • •Group 3: The agent (mixture or exposure circumstance) is not classifiable as to its carcinogenicity to humans. • •Group 4: The agent (mixture) is probably not carcinogenic to humans. • Group 1 (Carcinogenic to humans) Group 2A (Probably carcinogenic) Příklad Karcinogenita cytostatických (protinádorových) léčiv Risk / Benefit analýza à I přes vysoká rizika: využití jako léčiva •Obratlovci vs. ALTERNATIVY • –Obratlovci – tj. in vivo (celá zvířata) •Řada etických a praktických (finančních) limitací –Náhrada in vivo experimentů - koncept "3R" •Reduction (Snižování), •Refinement (Zmírňování), •Replacement (Nahrazování) • –Alternativní metody •ex vivo (orgány zvířat) •in vitro (buňky, buněčné linie, enzymy …) – –Výhody alternativních metod –snižování počtů zvířat –mechanistické metody (poznání biochemických principů – např. "dioxinová" toxicita, „inhibice acetylcholinesterázy“ u pesticidů) –rychlejší, levnější, možnost hodnocení více vzorků – GLP 6 Bezpečnost chemických látek pro člověka Alternativní biologické modely Alternativní metody •Mezinárodní agentury pro validaci alternativních postupů (cílem je „3R“) –ICVAM (USA) –EU: ecvam.jrc.it •ECVAM (European Centre for Validation of Alternative Methods) •Časopis ATLA (Alternatives to Laboratory Animals) • •Kompletní návody na validované postupy (tedy ověřené), které splňují 3R. •Velká většina není (bohužel) uznána standardizačními agenturami (OECD) a proto nejsou často užívány v praxi průmyslem http://ecvam.jrc.ec.europa.eu/ http://iccvam.niehs.nih.gov/ Seriozní projekty podpory alternativních metod TOXIKOLOGIE - http://alttox.org Seriozní projekty podpory alternativních metod EKOTOXIKOLOGIE - http://www.euroecotox.eu Seriozní projekty podpory alternativních metod EKOTOXIKOLOGIE – databáze testů http://projects.cba.muni.cz/euroecotox/ The Use of Alternatives to Testing on Animals for the REACH Regulation 2011 Reference: ECHA-11-R-004-EN, ISBN-13: 978-92-95035-96-6 Statistiky REACH 2011: Velmi malé % využití alternativ Alternativy 1: in vitro techniky (buněčné kultury, tkáňové explantáty) ____1 ____2 ____3 ____4 _1 Př: ECVAM - validovaná in vitro technika hodnocení embryotoxicity •Příklady – –CHEST Chick Embryotoxicity Screening Test – –FETAX Frog Embryo Teratogenesis Assay Xenopus (validovaná alternativa testů teratogenity) – -ZFET Zebrafish Embryo Toxicity Test (validace dle ISO) – Alternativy 2: embryonální testy kure1111a CHEST test - Injekce testované látky do vyvíjejícího se vajíčka à Hodnocení malformací 1 kontrola krivak FETAX test - Hormonální stimulace žab X. laevis à vajíčka - Expozice oplozených vajíček - 96 hodin kompletní vývoj embrya - Příklad – vliv herbicidu – paraquat Kontrolní embryo Malformace páteře ZFET - Zebřička, zebrafish (Danio rerio) -Obecně velmi významný modelový biologický organismus (!) - Indukce páření rozsvícením (fotoperioda) - Experimenty s vajíčky až embryi - vyhodnocení kulení, přežívání, malformací - do 4 dnů: ryby se vyživují z vaječného vaku •Využití informací o biologické aktivitě (toxicitě) u existujících látek à predikce pro neprostudované chemikálie •Mnoho různých přístupů (matematické, statistické …) •Příklad: OECD QSAR Toolbox www.qsartoolbox.org Alternativy 3: modely QSAR GLP 7 Bezpečnost chemických látek pro prostředí = ekotoxikologie Ekotoxikologie •Věda s řadou aplikací, jejímž cílem je racionálně chránit EKOSYSTÉM, populace a společenstva organismů (na rozdíl o toxikologie – předmětem je ochrana jednoho druhu = člověk) • •Ekosystém – složitá struktura a funkce bioty •Nutná je ochrana všech stupňů (trofické úrovně) –Producenti (řasy, rostliny …) –Konzumenti různých řádů (bezobratlí, obratlovci) –Destruenti (mikroorganismy) – •Nelze otestovat účinky na všechny druhy –– existují „modely“ = zástupci významných skupin (trofických stupňů) • •Hodnocení ekotoxicity – podobné principy jako toxikologie –– LC50 (letální koncentrace 50), EC50 (efektivní koncentrace 50 – např. reprodukční toxicita) –- NOEC – bezpečná hladina („no observed effect concentration“) –- Rovnováha ekosystému a význam potravních sítí Řasové testy toxicity Řasy Selenastrum capricornutum Scenendesmus subcapitatus Sc. quadricauda Chlorella vulgaris Příklady modelů hodnocení – Ekotoxikologické biotesty Producenti - ve vodě - v půdním prostředí figure4 figure4 Toxicita pro rostliny (terestrický ekosystém) - zástupci jednoděložných i dvouděložných (užívá se více druhů) figure4 Daphnia magna figure4 Artemia salina Ceriodaphnia dubia 1 Gammarus figure4 Chironomus riparius Příklady - Ekotoxikologické biotesty Konzumenti – bezobratlí – vodní prostředí figure4 Živorodka duhová (Paví očko), Poecilia reticulata figure4 Zebřička - Danio rerio (syn. Brachydanio rerio) figure4 Karas (zlatá forma) 1 Střevle - Pimephales promelas figure4 Pstruh Příklady - Ekotoxikologické biotesty Konzumenti – obratlovci – vodní prostředí figure4 figure4 Experimentální uspořádání – testování ekotoxicity ve vodním prostředí BAKTERIE – významný model v testování toxicity •Snadná kultivace, krátký generační čas, jednoduché uspořádání (jediná membrána), jednoduchý genetický aparát • •Využití při testování „bezpečnosti“ látek (i jiných vzorků – extrakty z potravin …) –rychlé (skreeningové) testy akutní toxicity (MICROTOX) –Testy na genotoxicitu - sledování poškození DNA: Amesův test TEST AKUTNÍ TOXICITY - MICROTOX - mořská luminiscenční bakteri Vibrio fisheri - krátkodobá expozice testované látce (5-30 min) - sledování změn přirozené luminiscence – odpovídá toxicitě - - uspořádání: kyvety (zkumavky), stanovení v luminometru - Mikrobiální ekotoxikologické biotesty figure4 1 ____1 ames - Test na reverzní mutace se Salmonella typhimurium - Původní kmen neroste na živném médiu - Látka vyvolá (reverzní) mutaci -> bakterie rostou Amesův test Existuje mnoho testovacích systémů …jaké testy se ale využívají v praxi? Jak vypadají návody? Standardizace v biologickém testování Standardní metody •V odborné literatuře - velké množství experimentálních metod • •Méně metod je standardizovaných a validovaných: • •STANDARDIZACE metod – výsledky akceptovatelné mezi státy – snižování nákladů / omezení opakovaných hodnocení •Přejímání standardizovaných metod do legislativ –např. ČR – Vyhl. 433/2004 Sb. – Metody testování toxicity (vychází z OECD guidelines – viz příklad: zákon ! (Příklad - PDF str. 16 – Akutní toxicita) • •Standardizační agentury: • OECD.org (! Velký význam – viz úvod do GLP/chemie) • ISO.org (Evropský dopad) • ASTM.org (USA) 5 hlavních sekcí OECD GUIDELINES – v rámci každé „standardizované postupy“ Section 1: Physical Chemical Properties Section 2: Effects on Biotic Systems (> 30 postupů) Section 3: Degradation and Accumulation (cca 10 postupů) Section 4: Health Effects (> 80 postupů) Section 5: Special Activities OECD GUIDELINES – Chemicals Testing www.oecd.org http://www.oecd.org Příklady – OECD Guidelines – sekce „2“ Effects on biotic systems (2010 - celkem 33 návodů) Příklady – OECD Guidelines – sekce „3“ Příklady – OECD Guidelines – sekce „4“ – Toxicita pro člověka – celkem 86 postupů (příklady dole) - Standardní postupy - akutní, chronickou, reprod. toxicita (viz dříve) GLP 8 Regulace Geneticky Modifikovaných Organismů (GMO) GMO v ČR •Zákon 153/2000 •Vyhlášky 372, 373, 374/2000 MŽP • •Definice: –Organismus •biologická jednotka (buněčná nebo nebuněčná) schopná rozmnožování nebo přenosu dědič. materiálu včetně virů –GMO •organismus (kromě člověka) změněný gen. modifikací • Genetická modifikace - zákon •Co je Genetická modifikace: ? –rekombinantní techniky vytvářející nové kombinace DNA - vložení nového úseku jakýmkoliv způsobem do NK, plazmidu, vektoru ... –techniky zavádějící děd. materiál připravený mimo organismus do organismu (mikroinjekce, mikroenkapsulace ...) –techniky buněčné fúze, hybridizace buněk (!produkce monoklonálních protilátek) • •Co není Genetická modifikace? –oplození in vitro –bakteriální konjugace a všechny podobné přirozené procesy –indukce polyploidie a haploidie –mutageneze –křížení • Proč regulovat GMO ? •Předběžná opatrnost –stále málo prostudováno –neznáme možné důsledky vnášení do prostředí, například: •přímé nebo nepřímé škodlivé působení na člověka, zvířata, rostliny »onemocnění (GM bakterie) »alergizace, toxicita •vliv na dynamiku populací a genetickou rozmanitost •omezení možnosti léčby (rezistence vůči ATB) •účinky na biogeochemické procesy (fixace dusíku, koloběh uhlíku ...) • Příklad – GM kukuřice s geny pro „Bt“ toxin z Bacillus thuringiensis - Toxiny působí proti škůdcům (? Působení toxinů z opadaných listů na biotu v půdě/vodě) Regulace GMO v ČR •Hlavní orgán: Ministerstvo ŽP, které registruje: –seznamy uživatelů (právnické osoby) –seznamy GMO •pro uzavřené nakládání •pro vnášení do prostředí (experimentální hodnocení v prostředí) •pro vnášení do oběhu (povoleno pro obchodování) • •Další orgány –ČIŽP, celní orgány, orgány veterinární správy, ÚKZÚZ, SZÚ, ÚSKVBL, ČZPI Povinnosti uživatele GMO •REGISTRACE –Složitá forma žádosti - řada požadavků (př. přesná definice genetické změny pro účely identifikace…) –Pověřené osoby (vzdělání, praxe ...) –Odborný poradce – •Před zápisem do seznamu je nutné provedení analýzy rizika a kategorizace konkrétního GMO - popis náležitostí je ve vyhlášce – Analýza rizika GMO - 4 kategorie •Po provedení analýzy rizika se GMO zařadí do kategorie: –A - bez rizika nebo s min. rizikem škodlivého působení –B - riziko, které může být odstraněno obecně známými opatřeními –C - riziko, které může být odstraněno jen zvláštními náročnými zásahy –D - riziko, které zanechává trvalé následky a nemůže být zcela odstraněno • •Podle kategorie rizika je nutno zabezpečit provoz zařízení –vybavení –provozní řád (režim SLP) •identifikace, osoby, seznam a popis pracovních postupů, výčet GMO a jejich počet, zásady vedení evidence o provádění sanitace, hygiena, vedení dokumentace ... •opatření pro případ havárie - speciální havarijní plán • Nakládání s GMO – důkladná dokumentace (SLP režim) •PLÁN ETAPY –účel, údaje o organismu, osoby, specifikace materiálu, postupy nakládání, likvidace, odpady –schválení odborným poradcem – •Provozní deník (každý zápis s podpisem) –plán etapy, průběh etapy –primární údaje (!) –zápisy o kontrolách – •Závěrečná zpráva etapy • •Průběžná archivace a reporting -> MŽP http://www.iraqa.in/images/k.jpg GLP: Good Laboratory Practice; GCP: Good Clinical Practice; GMP: Good Manufacturing Practice; GQP: Good Quality Practice; GVP: Good Vigilance Practice; VP: Pharmacovigilance PHARMACEUTICAL PRODUCT LIFE CYCLE AND REGULATIONS QUALITY ASSURANCE SPANNING THE ENTIRE PRODUCT LIFE CYCLE http://farm4.staticflickr.com/3230/2883487332_19fdf37e15_o.jpg