Klinická biochemie Petr Breinek (2013 - Petra Sýkorová) PF klinická biochemie N 2012 1 1. Základní informace o oboru klinická biochemie 2. Analyzovaný biologický materiál 3. Odběr a zacházení s biologickým materiálem 4. Vývoj klinické biochemie 5. Automatizace a používané analytické techniky 6. Řízení kvality a akreditace laboratoří 7. Kazuistiky 2 Laboratorní testy • Vliv na 70 - 80 % zdravotnických rozhodnutí v nemocniční péči při relativně nízkých nákladech, které činí 3 - 5 % nákladů na zdravotní péči Obor klinické biochemie a laboratorní diagnostiky se rozvíjí především s rozvojem: s Analytických technik S Informačních technologií 3 www.cskb.cz 4 Definice Klinická biochemie je klinicko-laboratorní obor poskytující významné informace pro: preventivní, diagnostickou a léčebnou péči napříč všemi lékařskými obory Definice (IFCC) Klinická chemie je aplikací chemických, molekulárních a buněčných principů a technologií s účelem porozumět lidskému zdraví a nemoci a umožnit jejich hodnocení International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) 6 Laboratorní obory ve zdravotnictví Klinická: Biochemie Hematologie Mikrobiologie Imunologie Genetika Toxikologie Soudní lékařství Alergologie Histologie Patologie Nukleární medicína Laboratorní medicína? Klinická patologie (USA) Laboratorní medicína (D) Klinická chemie Klinická biochemie Laboratorní diagnostika (SR) Laboratorní medicína nebo separované obory? Moderní technologie budou vyžadovat s velkou pravděpodobností integraci laboratorních služeb spojením centralizovaných laboratoří se systémy POCT (point of care testing) nejenom u lůžka nemocného, ale i v domácí péčí IQ^H Laboratorní obory musí spolupracovat nejen mezi sebou, ale především s klinickými lékaři 9 Základní trendy v laboratořích ❖ Laboratorní automatizace a robotika - Japonsko: plně automatizované laboratoře - ostatní: modulární automatizace 10 LIS (laboratorní informační systém) NIS (nemocniční laboratorní systém) Personální zajištění • VS vzdělaní pracovníci • lékaři • analytici, biochemici,farmaceuti,... • další • Středoškolsky vzdělaní pracovníci • zdravotní laboranti • Ostatní pracovníci • nižší zdravotničtí pracovníci • pomocní zdravotničtí pracovníci Charakteristické pro zdravotnické laboratorní obory je: • Analýza biologického materiálu • Včasná dostupnost výsledků • Požadovaná kvalita vyšetření (aplikace ISO 15189:2007) • Interpretace výsledků ANALYZOVANÝ MATERIÁL • B-KREV - VENÓZNÍ / ŽILNÍ - ARTERIÁLNÍ - KAPILÁRNÍ P-krevní PLAZMA NESRAZLIVA krev HEPARIN-Li,Na,NH4, EDTA CITRÁT OXALAT U- MOČ JEDNORÁZOVÁ SBÍRANÁ B-KREV S- SÉRUM P-PLAZMA U- MOČ MOZKOMÍŠNÍ MOK (likvor) STOLICE MOČOVÝ KÁMEN VÝPOTEK SLINY POT 3. Odběr a zacházení s )iologickým materiálen; 20 Příprava pacienta před odběrem biologického materiálu Informovanost pacienta ežim před odběrem Odběr biologického materiálu Načasování odběru Místo odběru Poloha při odběru Způsob odběru a odběrové systémy Turniket Odběr: Krev Moč Mozkomíšní mok Stolice Sliny, Pot, ... ODBEROVÉ SOUPRAVY JEDNORAZOVÉ SERUM gel x aktivátor srážení PLAZMA heparinNH4,Li,EDTA,NaF, ^ Odběr žilní krve Kapilární odběr - místa odběru Odběr vždy po hyperemizaci Preanalytická fáze - odber nesrázlivé krve Kapilární krev Arteriální krev Smíšená žilní krev Odběr musí být ■ anaerobní ■ bez bublin ■ s dokonalým promícháním krve s protisrážlivým činidlem Označení vzorku a žádanky • Laboratorní příručka Vojenskí MSfloaii« Brnu Oddätoi kliiiitkýtJi libonton 6it 00 B m 'j Zábrdovidá 3, Sanšmic-íOKL č. 00 '2010 LABORATORNÍ PRÍRUČKA lODDĚLENÍ KLINICKÝCH LABORATOŘÍ C. Min u á] pro odbery primárních norků. C-l Základ ni informace................................................................................ C-2 Požadavkove" listy (žádanky)................................................................. C-3 U s tni požadavky na vyšetřeni (dodatečná a opakovaná vyšetrení)... C-4 Používaný odberový systém.................................................................. C-5 Příprava pacienta přeď vyšetřením, odběr vzorku............................. C-6 Identifikace pacienta nažádance a označení vzorku.......................... C-7 Mn o zs tví vzorku..................................................................................... C-S Nezbytne" operace se vzorkem, stabilita............................................... C-9 Základni informace k bezpečností pri práci se vzorky..................................... C-10 Informace k doprave vzorku a k zajištění svozu vzorku................................ D. Preanahtické procesy v laboratoři.............................................................................. Dl Pŕijem žádanek a vzorku..................................................................................... D-2 Kriteria pro přijeti nebo odmítnutí vadných (kolizních) piiniainich vzorku D-3 Postupy pri nesprávné identifikaci vzorku nebo žádanky, D-4 Vvšetřování smluvními laboratořemi.................................. Povinné údaje na laboratorní žádance Transport biologického materiálu Donáška Automobilová a jiná přeprava Potrubní pošta Časová odezva (TAT, turnaround time) je doba, za kterou je k dispozici výsledek • TAT laboratorní • TAT celkový Automatizace laboratorní preanalytická fáze Četnost preanalytických chyb ■ Hemolýza 40 - 70% ■ Nevhodný vzorek 19- 46% ■ Chybná identifikace 1 - 2% (značení odběrových nádobek/zkumavek 50%, zadávání dat do LIS 22%) Hemolýza > in vitro > 98% > in vivo < 2% ovlivňuje minimálně 40 análytů Vznik hemolýzy (in vitro) • Odběr • Transport • Zacházení • Skladování (mimo i v laboratoři) Mechanismy působení hemolýzy • Uvolnění hemoglobinu a dalších intracelulárních látek do séra nebo plazmy - zvýšení koncentrace (K, LD,...) - snížení koncentrace (Glukóza, Na,...) • Chemická interference (ovlivnění CK adeny látkinázou,...) • Spektrofotometrická interference 1930 - 1950 ■ Metabolismus glukózy (Meyerhof) ■ pH metry ■ Citrátový cyklus (Krebs, Szent-Gyorgyi) ■ Koenzymy NAD, FMN, FAD (Warburg) ■ Ultracentrifugy (Svedberg) ■ UV-VIS spektrofotometry ■ Rozdělovači chromatografie ■ Mikroskopy 38 1950-60: laboratoře jako součást interní medicíny, neurologie, patologie,... ■ Titrační metody ■ Vážková analýza ■ Plamenové emisní fotometry ■ Elektroforéza ■ Alfa-šroubovice proteinů (Pauling) ■ Struktura glykogenu 1960-70 ■ 3D struktura proteinů (Phillips) ■ Genetický kód ■ Polarografie ■ Atomová absorpční spektrofotometrie (AAS) ■ První automatické analyzátory (Technicon) ■ Rozvoj enzymové diagnostiky ■ Vyšetřování vnitřního prostředí ■ Zavádění mikrometod a mechanizace 40 Auto Analyzer (Technicon) Průtokový systém, nejprve 1 kanál = 1 metoda SMA 6/60 a 12/60 (Technicon) 1970-90 Metabolické cesty a jejich regulace Sekvenování NK (Sanger) Nové enzymy Imunoanalytické metody (RIA, IEF, ELISA,. Rozvoj enzymologie Rozvoj automatických analyzátorů ISE elektrody Laboratorní informační systémy (LIS) Rozvoj HPLC mm Jjjfc mám Ä¥ 1990-dnešek Průtoková cytometrie CZjl Kapilární elektroforéza —> Modulární systémy ^^^^^ vjHik _ 10 10 LIS, NIS, čárové kódy^^^ j J!^ Automatizace preanalytické fáze Automatizace imunoanalytických metodlj.lfflpl Luminiscenční metody m/Ě lil Akreditace a certifikace laboratoří I li objev PCR a dalších technik DNA a RNA analýzy 44 5. Automatizace a pou analvtické tec Specifické rysy (procesy) klinicko - biochemické analytiky Požadavek —> Výsledek (informace) Analytická fáze / Postanalytická fáze Analytická fáze nemůže korigovat chyby fáze preanalytické (G.von Preanalytické chyby (50-80% všech lab. chyb) ■ Chybná identifikace žádanek a vzorků ■ Chybný odběr vzorků (hemolýza, vysrážení, objem...) Transport vzorků Bez poškození 75,6% ■ zachyceno laboratoří nebo lékařem Nevhodná léčba 0,6% ■ možnost fatálních následků Zdržení terapie 5,6% ■ důsledky pro zdraví i ekonomiku Opakování vyšetření 16,9% ■ v dnešní ekonomické situaci velmi nepříjemné ■ 284.270 přijatých žádanek ■i: (* 35.530 měsíčně) 1.344 odmítnutých žádanek: ■ 33 % chybí zkumavka ■ 23 % chybí žádanka ■ 21 % neoznačená zkumavka ' ■ 12 % neoznačená žádanka ■ 5 % nesouhlasí identifikace žádanka/zkumavka ■ 4 % odběr do špatné zkumavky ■ 0,7 % dodaná prázdná zkumavka 12 47 aboratorní automatizaci můžeme rozdělit do dvou hlavních směrů: Upíná laboratorní automatizace Modulární laboratorní automatizace Rozdělení automatických analyzátorů • CHEMICKÉ (homogenní analýza) Průtokové (historie) - Centrifugační (historie) - Diskrétní -Suchá chemie • IMUNOCHEMICKÉ (heterogenní analýza) Automatické analyzátory Selektivní = provádějí jen požadované analýzy Programovatelné (řízené PC, tj. postup analýzy, údržba, výpočty, QC,...) identifikace reagencií i vzorků čárovými kódy Komunikace analyzátoru on-line s LIS Možnost spojení s preanalytickými procesy rychlost: (nejčastěji 100-2 000 analýz/ h • objemy: analyzovaných vzorků 1 - 30 ul reakční směsi 80 - 300 ul • mycí stanice (kyvety,dávkovače, míchadla) • řídící jednotka (PC) • speciální software • odvíčkování, centrifugace, alikvotace, identifikace, uskladnění vzorků OKBH FN Brno • Více než 2000 vzorků denně, cca 4 milióny testů ročně, provoz 24 hod. denně •Automatizace analytické části od r.1989 • Automatizace perianalytické části od r.2008 Nárůst počtu vyšetření H911 (Hitachi) Cobas 8000 (Roche) https://edis.upol.cz/plain-l/av object-48382 IriCell (Iris) močový analyzátor F □c o o o o o o o ° O G o o o o 0 0 o 0 o o 0 0 o o e o o o c o o o z O o o o o o o o 0 o e •1 0 O o 0 O o o o o o o o °J o 0 o 0 o e 0 o o o o °1 o o © o o • o 0 o o 0 Q 0 0 0 o o o o o o o 0 o O • c 9 o o 0 o 0 0 e o 0 C • 0 O o 0 o o o o e o o o 0 0 o p D Erytrocyty Lu I 769 fuL 1 i* ^1^1 # 1 ;^ 1 9 c é 9 Í3T* Í2R> s> # ý ® @ C- IS Ä' 4ľ2ť :V Kvalita Definice kvality je orientována na splnění požadavků zákazníka (ordinujícího lékaře) Často vnímáme kvalitu subjektivně ■ Kvalitu musíme prokazovat (požadavek plátců zdravotní péče =ZP) ■ Požadavky na kvalitu se mění ■ Chyby ne vznikaj í j en v laboratoři ! Garance kvality ve zdravotnictví uznávané VZP 1. Akreditace podle ČSN EN ISO 15189:2007 2. Certifikace podle ČSN EN ISO 9001:2009 3. Národní akreditační systém dle SAK (Spojená akreditační komise MZ ČR) 4. Mezinárodní akreditační systém JCI (Joint Commission International) 5. e-ISO (Česká společnost pro akreditaci ve zdravotnictví) Akreditace Akreditace = oficiální uznání, že laboratoř je způsobilá provádět zkoušky > norma ČSN EN ISO 15189:2007) je základní normou pro posouzení způsobilosti klinických laboratoří Podstata akreditace spočívá ve: • Standardizaci (= přesný popis procesů, nastavení přesných pravidel, kontrolních mechanismů,.....) • Vybudování funkčního systému managementu • Posouzení kompetence pracovníků • Neustálém zlepšování služeb Akreditace, certifikace, audit Akreditační Orgán V CR: ClA.Český institut pro akreditaci NASKL, Národní autorizační středisko klinických laboratoří cls jep) Audit i a ii Certifikace = ověření fungování vybudovaného systému řízení (čsn en isoqooi:2oo9) Interní a externí audit Jaké vyšetřovací metody můžeme používat? • Laboratoř smí používat pouze produkty se značkou CE (Evropská unie; Od 7.12.2005 ) • Výrobce zaručuje, že výrobek splňuje direktivu IVD 98/79 EC, tj. požadavky na zdravotnické prostředky in vitro • Výrobek je validovaný a má mít metrologickou návaznost hodnot kalibrátorů a kontrolních přípravků Validace a verifikace S Validace -splnění požadavků na měřící postup s ohledem na jeho zamýšlené použití -důkaz ve formě dokumentace, že metoda bude poskytovat výsledky odpovídající předem určené specifikaci - validuje výrobce diagnostik (direktiva ivd 98/79 ec), případně i laboratoř (je to obtížné) ^Verifikace -potvrzení, že laboratoř je schopná validovaný měřící postup správně provádět -verifikuje laboratoř Co se validuje a verifikuje Analytické znaky metody • Preciznost a vychýlení (náhodné a systematické chyby) • Pracovní rozsah/ linearita • Citlivost (mez detekce/ stanovitelnosti) • Interference • Robustnost • Porovnání s jinou metodou Při verifikaci ověřujeme, že jsme v laboratoři schopni dodržovat uvedené analytické znaky metody Nejistota (Uncertainty) • Nejistota = kombinace náhodné a systematické chyby • Normy řízení kvality ukládají každé laboratoři vyhodnotit nejistoty svých měření *j*±vl Návaznost provázání rutinních měření s referenčními metodami a referenčními materiály • Realizace návaznosti v klinické laboratoři je velmi obtížná (u biologických analytů je k dispozici referenční materiál/metoda pouze u10 - 20% analytů) Jak ji můžeme zjistit?—>• rozborem dokumentace výrobce Detekce laboratorních chyb • Vnitřní kontrola kvality (VKK, IKK) Postupy uplatňované pracovníky laboratoře s cílem získat co nej větší míru pravděpodobnosti, že vydávané výsledky j sou maximálně věrohodné Software: - v řídící jednotce analyzátorů -v LIS - externí programy • Externí hodnocení kvality (EHK) - Detekce systematické chyby (vychýlení,bias) - Srovnání preciznosti (přesnosti) s jinými - Přispívá k odhadu nejistoty výsledků měření Regulační diagramy HTML viewer + - 1=1 Q, Ľl X Y ill f U_CLo on lot 62761 by 1650_1 mmol/L 112.3 107 ■ 91.1 S5.S 11 21 31 41 51 61 71 31 91 1- f 1 1 i 1 101 111 Target value: 107.OG, Target deviation: 5.30 Cumulative N: 115, Mean: 112.12, SD: 1.97, CV%: 1.76 Stanovení požadavků na kvalitu • Empiricky (state of art) • Biologické variability, TEbj0, • Klinické požadavky • Doporučení odborných společností • Data výrobců IVD (z validace) • Systém six sigma (6a) • Celková analytická chyba, TEa Příklad: Výpočet TMU (cílové nejistoty měření) z biologické variability pro stanovení S-kreatininu Intraindividuální biologická variabilita 5,3 Přesnost odvozená z biologických variabilit 2,7 Interindividuální biologická variabilita 14,2 Bias odvozený z biologických variabilit 3,8 celková biologická variabilita 15,2 Celková chyba odvozená z biologických variabilit 8,2 vwwv.westnard.com Teoretická TMU(%) 8,2 7. Kazuistiky Kazuistika I DIABETES MELLITUS mellitus „sladký" diabetes „propouštět" Pncina • Organismus nevytváří dostatek inzulínu nebo není schopen inzulín patřičně využít • Charakteristická je chronická hyperglykémie (= zvýšená koncentrace glukózy v krvi) • Je to onemocnění s několika zcela odlišnými mechanismy vzniku Gestační diabetes mellitus (těhotenská cukrovka) • Každá porucha metabolismu glukózy, která se projevuje nedostatečným působením inzulínu v těle diagnostikovaná u těhotné ženy, při které dochází ke zvýšení koncentrace glukózy v krvi • Gestační diabetes je laboratorně diagnostikován, je-li dosaženo aspoň jednoho ze dvou uvedených kriterií: • FPG (Fasting Plasma Glucose) > 5,6 mmol/1 • P-glukóza po 2 hodinách > 7,7 mmol/1 Gestační diabetes mellitus Nebezpečí pro plod, který na zvýšenou koncentraci glukózy v matčině krvi reaguje zvýšenou produkcí vlastního inzulínu (patří k růstovým faktorům) a začne přibývat rychleji na váze (defekty nervové trubice, fetální obezita, hypoglykémie po porodu, nebezpečí vzniku diabetu v dospělosti) Vyšetření oGTT: mezi 24.-28.týdnem gravidity při vysokém riziku v prvním trimestru gravidity Většině žen s těhotenskou cukrovkou stačí dieta (do konce těhotenství i v šestinedělí), výjimečně nasazení inzulínu. Po ukončení gravidity je nutné provést rekvalifikaci gestačního diabetu 75 oGTT u těhotných - kazuistiky Kazuistika - A P-glykémie nalačno 5,8 mmol/1 Závěr: Glykémie nalačno u těhotné svědčí pro gestační diabetes mellitus. Opakujte odběr žilní nesrážlivé krve nalačno. oGTT neproveden. Kazuistika - B P-glykémie nalačno 4,8 mmol/1, za 2 h 7,9 mmol/1 Závěr: Glykémie 2 h po zátěži u těhotné svědčí pro gestační diabetes mellitus doporučení ČDS a ČSKB Algoritmus pro laboratorní screening gestačního DM Těhotná vysoce riziková (prítomný alespoň dva rizikové faktory) co nejdříve1 v prvním trimestru Každá tehotná 24. - 28, týden gravidity {s výjimkou těhotných 3 nízkým rizikem gestačního diabetu) TT Glukóza v plazme žilni krve nalačno Tehotná vysoce riziková, negativní oGTT v prvním trimestru opakuj OGTT 24. - 2B. týden > £,6 mmol/l Opakuj odběr žilni krve nalačno * 5,6 mmol/l T ogtt - who ^zátěž 75 g glukózy, standardní oGTT, odběr venózni krve nalačno a dvě hodiny po zátěži) Glukóza v plazmě žilní krve > 5,6 mmol/l nalačno Glukóza v plazmě žilni k-ve > 7,7 mmol/l dvě ho díry po zátéžl glukózou Splněno alespoň 1 kriterium Gestační diabetes mellitus (IFG, DM -diagnostikováno u těhotné} Kazuistika II TDM Terapeutické monitorování lékových hladin Proč se u některých léků stanovuje jejich koncentrace? • Hrozí j ej ich toxický účinek při predávkovaní např. nefrotoxicita, ototoxicita • Některé mají úzké terapeutické rozmezí (Rozmezí mezi nej nižší koncentrací léku, při které se objevuje jeho účinek a nejvyšší koncentrací, při které se ještě neobjevuje toxický účinek léku) • Lékař pozoruje nedostatečný účinek • Je potřeba kontrolovat terapii • Je podezření, že pacient léky neužívá (compliance = spolupráce pacienta) Léky j sou metabolizovány • U stanovovaných léků je jejich metabolizmus znám • Přibližně u 20% osob probíhá odbourávání léčiv jinou rychlostí, než u většiny osob —> vzniká problém při stanovení dávky léku 80 Co to způsobuje? Dlouhou dobu se to nevědělo: lék se vysadil nebo změnil • U pomalých metabolizátorů je to často zapříčiněno geneticky: vrozené „chybění'' nebo změněná funkce některého enzymu (např. cytochrom P450 se podílí na metabolismu asi 30% používaných léků) Lithium - antidepresiva • Profylaxe dalších fází maniodepresivního onemocnění • Malá terapeutická šíře • Zvýšená konc. lithia —> hyponatremie, snížená glomerulární filtrace • Kontrola v týdenních intervalech, později jednou za měsíc • Bez pravidelné kontroly hladiny léčívaje terapie nepřípustná Frederick Sanger ŕ* 13. srpna 1918, f 19. listopadu 2013) • britský biochemik • dvojnásobný nositel Nobelovy ceny :