PF_uvod KB_2006 1 Petr Breinek Klinická biochemie (2013 P t Sýk á) PF_klinická biochemie_N 2012 1 (2013 - Petra Sýkorová) Témata 1. Základní informace o oboru klinická biochemie 2. Analyzovaný biologický materiál 3. Odběr a zacházení s biologickým materiálem 2 4. Vývoj klinické biochemie 5. Automatizace a používané analytické techniky 6. Řízení kvality a akreditace laboratoří 7. Kazuistiky Laboratorní testy • Vliv na 70 - 80 % zdravotnických rozhodnutí v nemocniční péči při relativně nízkých nákladech, které činí 3 - 5 % nákladů na zdravotní péči 3 Obor klinické biochemie a laboratorní diagnostiky se rozvíjí především s rozvojem: Analytických technik Informačních technologií 1. Obor klinická biochemie 4 www.cskb.cz Klinická biochemie je klinicko-laboratorní obor poskytující významné informace pro: ti í Definice 5 preventivní, diagnostickou a léčebnou péči napříč všemi lékařskými obory Klinická chemie je aplikací chemických, molekulárních a buněčných principů a technologií Definice (IFCC) 6 s účelem porozumět lidskému zdraví a nemoci a umožnit jejich hodnocení International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) PF_uvod KB_2006 2 Laboratorní obory ve zdravotnictví Klinická: Biochemie Hematologie Genetika Toxikologie 7 g Mikrobiologie Imunologie Soudní lékařství Alergologie Histologie Patologie Nukleární medicína Laboratorní medicína? Klinická patologie (USA) Laboratorní medicína (D) Klinická chemie 8 Klinická biochemie Laboratorní diagnostika (SR) ….. Laboratorní medicína nebo separované obory? Moderní technologie budou vyžadovat s velkou pravděpodobností integraci laboratorních služeb spojením centralizovaných laboratoří se systémy POCT (point of care testing) nejenom u lůžka 9 POCT (point of care testing) nejenom u lůžka nemocného, ale i v domácí péčí Laboratorní obory musí spolupracovat nejen mezi sebou, ale především s klinickými lékaři Základní trendy v laboratořích Laboratorní automatizace a robotika - Japonsko: 10 plně automatizované laboratoře - ostatní: modulární automatizace Základní trendy v laboratořích Laboratorní automatizace a robotika Informační systémy 11 LIS (laboratorní informační systém) NIS (nemocniční laboratorní systém) Personální zajištění • VŠ vzdělaní pracovníci • lékaři • analytici, biochemici,farmaceuti,… d lší 12 • další • Středoškolsky vzdělaní pracovníci • zdravotní laboranti • Ostatní pracovníci • nižší zdravotničtí pracovníci • pomocní zdravotničtí pracovníci PF_uvod KB_2006 3 Charakteristické pro zdravotnické laboratorní obory je: • Analýza biologického materiálu • Včasná dostupnost výsledků 13 Včasná dostupnost výsledků • Požadovaná kvalita vyšetření (aplikace ISO 15189:2007) • Interpretace výsledků 2. Analyzovaný biologický materiál 14 ANALYZOVANÝ MATERIÁL • B-KREV – VENÓZNÍ / ŽILNÍ – ARTERIÁLNÍ KAPILÁRNÍ– KAPILÁRNÍ • S-krevní SÉRUM – SRÁŽLIVÁ krev doba srážení 30min a více centrifugace 10 min, 1500x gg , g • P-krevní PLAZMA – NESRÁŽLIVÁ krev HEPARIN-Li,Na,NH4, EDTAEDTA CITRÁT OXALÁT • U- MOČ JEDNORÁZOVÁ SBÍRANÁ PF_uvod KB_2006 4 • B- KREV • S- SÉRUM • P-PLAZMA • U- MOČ • MOZKOMÍŠNÍ MOK (likvor)MOZKOMÍŠNÍ MOK (likvor) • STOLICE • MOČOVÝ KÁMEN • VÝPOTEK • SLINY • POT 3. Odběr a zacházení s biologickým materiálem 20 • Informovanost pacienta • Režim před odběrem Příprava pacienta před odběrem biologického materiálu • Načasování odběru • Místo odběru • Poloha při odběru Z ů b dbě dbě é té Odběr biologického materiálu • Způsob odběru a odběrové systémy • Turniket • Odběr: Krev Moč Mozkomíšní mok Stolice Sliny, Pot, … ODBĚROVÉ SOUPRAVY • JEDNORÁZOVÉ • SÉRUM gel x aktivátor srážení • PLAZMA heparinNH4,Li,EDTA,NaF, Odběr žilní krve PF_uvod KB_2006 5 Kapilární odběr – místa odběru Odběr vždy po hyperemizaci Preanalytická fáze – odběr nesrážlivé krve Kapilární krev Arteriální krev Smíšená žilní krev Odběr musí být anaerobní bez bublin s dokonalým promícháním krve s protisrážlivým činidlem • Laboratorní příručka Označení vzorku a žádanky Povinné údaje na laboratorní žádance • Donáška • Automobilová a jiná přeprava • Potrubní pošta Transport biologického materiálu Časová odezva (TAT, turnaround time) je doba, za kterou je k dispozici výsledek • TAT laboratorní • TAT celkový Automatizace laboratorní preanalytická fáze A vstup vzorků a jejich identifikace F zazátkování B centrifugace G roztřídění alikvotů C odzátkování H třídění vzorků (rerun) D alikvotaceD alikvotace E označování čárovými kódy Modular Preanalytics, Roche) PF_uvod KB_2006 6 Četnost preanalytických chyb Hemolýza 40 - 70% Nevhodný vzorek 19 46%Nevhodný vzorek 19 – 46% Chybná identifikace 1 – 2% (značení odběrových nádobek/zkumavek 50%, zadávání dat do LIS 22%) Hemolýza in vitro > 98% in vivo < 2% li ň j i i ál ě 40 l tůovlivňuje minimálně 40 analytů Vznik hemolýzy (in vitro) • Odběr • Transport • Zacházení Skl d á í ( i i l b t ři)• Skladování (mimo i v laboratoři) Mechanismy působení hemolýzy • Uvolnění hemoglobinu a dalších intracelulárních látek do séra nebo plazmy - zvýšení koncentrace (K, LD,…) snížení koncentrace (Glukóza Na )- snížení koncentrace (Glukóza, Na,…) • Chemická interference (ovlivnění CK adenylátkinázou,…) • Spektrofotometrická interference 4. Vývoj klinické biochemie 36 PF_uvod KB_2006 7 Pokrok v laboratorních technologiích Od manuálních metod a POCT k automatizované analýze 1930 – 1950 Metabolismus glukózy (Meyerhof) pH metry Citrátový cyklus (Krebs, Szent-Gyorgyi) 38 Koenzymy NAD, FMN, FAD (Warburg) Ultracentrifugy (Svedberg) UV-VIS spektrofotometry Rozdělovací chromatografie Mikroskopy 1950-60: laboratoře jako součást interní medicíny, neurologie, patologie,… Titrační metody Vážková analýza 39 Vážková analýza Plamenové emisní fotometry Elektroforéza Alfa-šroubovice proteinů (Pauling) Struktura glykogenu 1960-70 3D struktura proteinů (Phillips) Genetický kód Polarografie Atomová absorpční spektrofotometrie (AAS) První automatické analyzátory (Technicon) 40 y y ( ) Rozvoj enzymové diagnostiky Vyšetřování vnitřního prostředí Zavádění mikrometod a mechanizace AutoAnalyzer (Technicon) 41 Průtokový systém, nejprve 1 kanál = 1 metoda SMA 6/60 a 12/60 (Technicon) 42 6 kanálů (6 metod) 12 kanálů (12 metod) PF_uvod KB_2006 8 1970-90 Metabolické cesty a jejich regulace Sekvenování NK (Sanger) Nové enzymy Imunoanalytické metody (RIA, IEF, ELISA,…) Rozvoj enzymologie Rozvoj automatických analyzátorů 43 Rozvoj automatických analyzátorů ISE elektrody Laboratorní informační systémy (LIS) Rozvoj HPLC 1990 - dnešek Průtoková cytometrie Kapilární elektroforéza Modulární systémy LIS, NIS, čárové kódy Mikročipy 44 Automatizace preanalytické fáze Automatizace imunoanalytických metod Luminiscenční metody Akreditace a certifikace laboratoří objev PCR a dalších technik DNA a RNA analýzy 5. Automatizace a používané analytické techniky 45 Specifické rysy (procesy) klinicko - biochemické analytiky Analytická fáze Požadavek → Výsledek (informace) Preanalytická fáze y Postanalytická fáze Analytická fáze nemůže korigovat chyby fáze preanalytické (G.von B i ) Preanalytické chyby (50-80% všech lab. chyb) 47 48 PF_uvod KB_2006 9 • CHEMICKÉ (homogenní analýza) Průtokové (historie) – Centrifugační (historie) – Diskretní – Suchá chemie • IMUNOCHEMICKÉ (heterogenní analýza) Rozdělení automatických analyzátorů 49 • Jiné: CHROMATOGRAFICKÉ MOČOVÉ POCT Automatické analyzátory Selektivní = provádějí jen požadované analýzy Programovatelné (řízené PC, tj. postup analýzy údržba výpočty QC ) 50 analýzy, údržba, výpočty, QC,...) identifikace reagencií i vzorků čárovými kódy Komunikace analyzátoru on-line s LIS Možnost spojení s preanalytickými procesy • rychlost: ( nejčastěji 100 - 2 000 analýz/ h • objemy: analyzovaných vzorků 1 - 30 ul reakční směsi 80 - 300 ul • mycí stanice (kyvety,dávkovače, míchadla) 51 • řídící jednotka (PC) • speciální software • odvíčkování, centrifugace, alikvotace, identifikace, uskladnění vzorků Nárůst počtu vyšetření OKBH FN Brno • Více než 2000 vzorků denně, cca 4 milióny testů ročně, provoz 24 hod. denně •Automatizace analytické části od r.1989 • Automatizace perianalytické části od r.2008 y 0 500 000 1 000 000 1 500 000 2 000 000 2 500 000 3 000 000 3 500 000 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 rok početvyšetřenízarok H 911 (Hitachi) 53 Cobas 8000 (Roche) 54https://edis.upol.cz/plain-1/av_object-48382 PF_uvod KB_2006 10 IriCell (Iris) močový analyzátor 55 56 6. Řízení kvality a akreditace laboratoří 57 Kvalita Často vnímáme kvalitu subjektivně Kvalitu musíme prokazovat (požadavek plátců zdravotní péče =ZP) Definice kvality je orientována na splnění požadavků zákazníka (ordinujícího lékaře) 58 (p p p ) Požadavky na kvalitu se mění Chyby nevznikají jen v laboratoři ! 1. Akreditace podle ČSN EN ISO 15189:2007 2. Certifikace podle ČSN EN ISO 9001:2009 Garance kvality ve zdravotnictví uznávané VZP 59 3. Národní akreditační systém dle SAK (Spojená akreditační komise MZ ČR) 4. Mezinárodní akreditační systém JCI (Joint Commission International) 5. e-ISO (Česká společnost pro akreditaci ve zdravotnictví) Akreditace = oficiální uznání, že laboratoř je způsobilá provádět zkoušky norma ČSN EN ISO 15189:2007) je základní normou pro posouzení způsobilosti klinických laboratoří Akreditace 60 Podstata akreditace spočívá ve: • Standardizaci (= přesný popis procesů, nastavení přesných pravidel, kontrolních mechanismů,…..) • Vybudování funkčního systému managementu • Posouzení kompetence pracovníků • Neustálém zlepšování služeb PF_uvod KB_2006 11 Akreditační orgán v ČR: ČIA,Český institut pro akreditaci NASKL, Národní autorizační středisko klinických laboratoří ČLS JEP) Audit I a II Akreditace, certifikace, audit 61 Certifikace = ověření fungování vybudovaného systému řízení (ČSN EN ISO 9001:2009) Interní a externí audit Jaké vyšetřovací metody můžeme používat? • Laboratoř smí používat pouze produkty se značkou CE (Evropská unie; Od 7.12.2005 ) • Výrobce zaručuje, že výrobek splňuje direktivuVý obce a učuje, e vý obe sp uje d e t vu IVD 98/79 EC, tj. požadavky na zdravotnické prostředky in vitro • Výrobek je validovaný a má mít metrologickou návaznost hodnot kalibrátorů a kontrolních přípravků Validace a verifikace Validace -splnění požadavků na měřící postup s ohledem na jeho zamýšlené použití -důkaz ve formě dokumentace, že metoda bude poskytovat výsledky odpovídající předem určené 63 poskytovat výsledky odpovídající předem určené specifikaci - validuje výrobce diagnostik (direktiva IVD 98/79 EC), případně i laboratoř ( je to obtížné) Verifikace -potvrzení, že laboratoř je schopná validovaný měřící postup správně provádět -verifikuje laboratoř Co se validuje a verifikuje Analytické znaky metody • Preciznost a vychýlení (náhodné a systematické chyby) • Pracovní rozsah/ linearita • Citlivost (mez detekce/ stanovitelnosti) I t f 64 • Interference • Robustnost • Porovnání s jinou metodou Při verifikaci ověřujeme, že jsme v laboratoři schopni dodržovat uvedené analytické znaky metody • Nejistota = kombinace náhodné a systematické chyby • Normy řízení kvality ukládají každé Nejistota (Uncertainty) 65 Normy řízení kvality ukládají každé laboratoři vyhodnotit nejistoty svých měření Návaznost provázání rutinních měření s referenčními metodami a referenčními materiály • Realizace návaznosti v klinické laboratoři je velmi obtížná (u biologických analytů je k dispozici 66 referenční materiál/metoda pouze u10 - 20% analytů) Jak ji můžeme zjistit?→ rozborem dokumentace výrobce PF_uvod KB_2006 12 Detekce laboratorních chyb • Vnitřní kontrola kvality (VKK, IKK) Postupy uplatňované pracovníky laboratoře s cílem získat co největší míru pravděpodobnosti, že vydávané výsledky jsou maximálně věrohodné Software: v řídící jednotce analyzátorů 67 Software: - v řídící jednotce analyzátorů - v LIS - externí programy • Externí hodnocení kvality (EHK) – Detekce systematické chyby (vychýlení,bias) – Srovnání preciznosti (přesnosti) s jinými – Přispívá k odhadu nejistoty výsledků měření Regulační diagramy 68 Stanovení požadavků na kvalitu • Empiricky (state of art) • Biologické variability, TEbiol • Klinické požadavky 69 • Doporučení odborných společností • Data výrobců IVD (z validace) • Systém six sigma (6σ) • Celková analytická chyba, TEa Příklad: Výpočet TMU (cílové nejistoty měření) z biologické variability pro stanovení S-kreatininu 70 7. Kazuistiky 71 Kazuistika I DIABETES MELLITUS 72 DIABETES MELLITUS mellitus „sladký“ diabetes „propouštět“ PF_uvod KB_2006 13 Příčina • Organismus nevytváří dostatek inzulínu nebo není schopen inzulín patřičně využít • Charakteristická je chronická hyperglykémie 73 • Charakteristická je chronická hyperglykémie (= zvýšená koncentrace glukózy v krvi) • Je to onemocnění s několika zcela odlišnými mechanismy vzniku Gestační diabetes mellitus (těhotenská cukrovka) • Každá porucha metabolismu glukózy, která se projevuje nedostatečným působením inzulinu v těle, diagnostikovaná u těhotné ženy, při které dochází ke zvýšení koncentrace glukózy v krvi G č í di b j l b ě di ik á 74 • Gestační diabetes je laboratorně diagnostikován, je-li dosaženo aspoň jednoho ze dvou uvedených kriterií: • FPG (Fasting Plasma Glucose) ≥ 5,6 mmol/l • P-glukóza po 2 hodinách ≥ 7,7 mmol/l Gestační diabetes mellitus • Nebezpečí pro plod, který na zvýšenou koncentraci glukózy v matčině krvi reaguje zvýšenou produkcí vlastního inzulinu (patří k růstovým faktorům) a začne přibývat rychleji na váze (defekty nervové trubice, fetální obezita, hypoglykémie po porodu, nebezpečí vzniku diabetu v dospělosti) 75 Vyšetření oGTT: mezi 24.-28.týdnem gravidity při vysokém riziku v prvním trimestru gravidity • Většině žen s těhotenskou cukrovkou stačí dieta (do konce těhotenství i v šestinedělí), výjimečně nasazení inzulinu. Po ukončení gravidity je nutné provést rekvalifikaci gestačního diabetu oGTT u těhotných - kazuistiky Kazuistika - A P-glykémie nalačno 5,8 mmol/l Závěr: Glykémie nalačno u těhotné svědčí pro gestační diabetes mellitus. Opakujte odběr žilní nesrážlivé krve nalačno 76 nesrážlivé krve nalačno. oGTT neproveden. Kazuistika - B P-glykémie nalačno 4,8 mmol/l, za 2 h 7,9 mmol/l Závěr: Glykémie 2 h po zátěži u těhotné svědčí pro gestační diabetes mellitus 77 Kazuistika II TDM 78 TDM Terapeutické monitorování lékových hladin PF_uvod KB_2006 14 Proč se u některých léků stanovuje jejich koncentrace? • Hrozí jejich toxický účinek při předávkování např. nefrotoxicita, ototoxicita • Některé mají úzké terapeutické rozmezí (Rozmezí mezi nejnižší koncentrací léku při které se objevuje jehomezi nejnižší koncentrací léku, při které se objevuje jeho účinek a nejvyšší koncentrací, při které se ještě neobjevuje toxický účinek léku) • Lékař pozoruje nedostatečný účinek • Je potřeba kontrolovat terapii • Je podezření, že pacient léky neužívá (compliance = spolupráce pacienta) Léky jsou metabolizovány • U stanovovaných léků je jejich metabolizmus znám 80 • Přibližně u 20% osob probíhá odbourávání léčiv jinou rychlostí, než u většiny osob → vzniká problém při stanovení dávky léku Co to způsobuje? Dlouhou dobu se to nevědělo: lék se vysadil nebo změnil 81 • U pomalých metabolizátorů je to často zapříčiněno geneticky: vrozené ,,chybění‘‘ nebo změněná funkce některého enzymu (např. cytochrom P450 se podílí na metabolismu asi 30% používaných léků) Lithium - antidepresiva • Profylaxe dalších fází maniodepresivního onemocnění • Malá terapeutická šíře Z ýš á k lithi h t i íž á• Zvýšená konc. lithia → hyponatremie, snížená glomerulární filtrace • Kontrola v týdenních intervalech, později jednou za měsíc • Bez pravidelné kontroly hladiny léčiva je terapie nepřípustná 83 Děkuji za pozornost 84 Frederick Sanger (* 13. srpna 1918, † 19. listopadu 2013) • britský biochemik • dvojnásobný nositel Nobelovy ceny :