Základní metodické přístupy v experimentální onkologii & Modelové systémy Experimentální modely v onkologii Obecné zásady při výzkumu: • Snaha porozumět fundamentálním procesům funkce a vývoje živých organismů • Formulace přesně definovaných otázek ve vymezené oblasti výzkumu • Výběr vhodného modelového systému (Mendel) • Zjednodušený, ale impaktní systém umožňující testovat specifickou hypotézu a zda se dosáhne výsledného fenotypu • Buněčné linie • Caenorhabditis elegans • Drosophila melanogaster • Kvasinky • Danio rerio • Mus musculus Příprava buněčných linií Nebezpečí kontaminace jinou buněčnou kulturou [DSMZ, ATCC (mikrosatelitní DNA fingerprinty)] Buňky se dělí a rostou dokud neobsáhnou celý prostor, pak následuje: • Zástava b. dělení kontaktní inhibicí • Indukce buněčné diferenciace kontaktní inhibicí • Akumulace apoptotických a nekrotických buněk • Deplece nutričních faktorů Práce s eukaryotickými buněčnými liniemi Optimální podmínky kultivace (5-10% CO2, 37 C, pH, glukóza, růstové faktory, antibiotika) Výměna média (pH), pasážování buněk, kryoprezervace 2D vs. 3D kultivace Konfluence buněk, suspenzní vs. adherentní buňky Genové manipulace Výhody a nevýhody buněčných linií • Prakticky neomezená životnost • Kontinuální a rychlá proliferace • Snadná práce • Možnost připravit stabilní KO, transientní transfekce, a další genetické manipulace • Atypické okolí nádorových buněk • Nebezpečí kros-kontaminací • Kumulace dalších změn Buněčné linie Vybavení Kultivační média Práce s b. liniemi Kryoprezervace Primokultury Výhody a nevýhody • Příprava monoklonálních protilátek • Vývoj buněčných vakcín Využití buněčných linií v biotechnologii Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) projekt Detailní genetická a farmakologická charakterizace panelu lidských nádorových linií (~1000) s cílem vytvořit model, který bude reflektovat vlastnosti lidských nádorů a usnadní/umožní volbu nejvhodnější terapie. Komparativní a (ko-)expresní analýza Caenorhabditis elegans Dobře pěstovatelný na petriho misce Velikost genomu 8x107 bp Pohlaví determinováno chromosomem X Drosophila melanogaster Malé, snadno pěstovatelné, krátký životní cyklus (2 týdny), relativně malý genom (1,4x108 bp), existence polytenních chromosomů, řada mobilních genetických elementů. Transformační systém využívající mobilní genetický element P, po injikaci do embrya – tvorba mozajek (využití např. při studiu tkáňově specifické exprese) Kvasinky (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe) Snadno kultivovatelné, 1. eukaryotický organismus plně osekvenovaný, celá řada funkčních homologů se savčími buňkami Vhodný model pro screening protinádorových léčiv Pozitivní selekční screening Příklad využití kvasinek při screeningu b. signalních drah při testování nových látek Danio rerio (Zebrafish) jako model pro p53 p53-mutant vznik tumorů ze Schwanných buněk p53-mutace + mutace B-raf vznik maligního melanomu Drosophila melanogaster Malé, snadno pěstovatelné, krátký životní cyklus (2 týdny), relativně malý genom (1,4x108 bp), existence polytenních chromosomů, řada mobilních genetických elementů. Transformační systém využívající mobilní genetický element P, po injikaci do embrya – tvorba mozajek (využití např. při studiu tkáňově specifické exprese) Chemoterapie (jednoduchá aplikace, velké množství ryb, dlouhodobá léčba x nespecifická, predominance jaterních tumorů, potenciální riziko pro výzkumníka) Transplantace savčích buněk (rychlost, průhledná embrya, lidské nádory, fluorescence x, nízká penetrance tumorů) Genetické knockouty (Inaktivace jednoho specifického genu - N-ethyl-N-nitrosourea mutageneze, „Human-like cancer“ mutace x slabá penetrance, genové duplikace, rozdílné spektrum tumorů, „background“ mutace) Exprese transgenů (jednoduše generovatelné injikací, použití lidských genů, použití fluorescence, tkáňově specifická exprese x nedostatek specifických promotorů) Mus musculus Příprava inbredních kmenů – možnost pokusů na geneticky uniformních organismech (více jak 700 mutovaných kmenů). Obvykle se provádí tzv. „ gene knockkout“, tzn. funkční geny jsou nahrazeny nefunkčními nebo mírně pozměněnými variantami jež odpovídají genetickým změnám vzniklým v nádorové buňce. Nejvýznamnější příspěvek k pochopení mechanismů lidských nádorových onemocnění. Mus musculus Příprava inbredních kmenů – možnost pokusů na geneticky uniformních organismech (více jak 700 mutovaných kmenů). Obvykle se provádí tzv. „ gene knockkout“, tzn. funkční geny jsou nahrazeny nefunkčními nebo mírně pozměněnými variantami jež odpovídají genetickým změnám vzniklým v nádorové buňce. Nejvýznamnější příspěvek k pochopení mechanismů lidských nádorových onemocnění. 4 metody přenosu GI: • Infekce buněk kostní dřeně rekombinantním retrovirem umožní expresi přeneseného genu v infikovaném zvířeti • Infekce embrya pomocí rekombinantního retrovirového vektoru • Transformace embryonálních kmenových buněk • Klonovaná DNA může být mikroinjikována do fertilizovaných oocytů a přenesena do náhradní matky *Náhodný charakter integrace  poziční efekt !!! (YACs & BACs) *Poprvé gen pro elastázu, nezbytná 134 bp regulační oblast pro správnou funkci „Hybridní transgen“ Knockout and knockin Využití homologní rekombinace u ES buněk (více jak 1000 genů “KO”) Obecné zásady při odběru klinického materiálu: • „logistika“ zpracování • manipulace s odběrovými nástroji • načasování Krev (5-10 ml, chelatační činidla, vyšetření zánětlivých determinant, hladiny cukrů, hormonů, onkomarkerů, bílkovin krevního séra a dalších.) Separace krevních buněk • Imunoafinitní separace • Imunomagnetická separace • Sortování buněk Odběr biologického materiálu Sérum (55% celkové krve) Leukocyty a trombocyty (<1% celkové krve) Erytrocyty (45% celkové krve) A B Vstupní vzorek Průběh centrifugace Výsledná separace Základní separační techniky Separační techniky využívající monoklonální protilátky A Buňka X Buňka X Buňka Y Protilátka Specifický antigen Nosič B Další biologický materiál - Kostní dřeň - Moč - Sliny - Bukální sliznice - Plodová voda - Choriové klky - Fibroblasty (kožní biopsie) - Tkáně – N2 – FFPE Přehled způsobů odběru tkáně Kleště A B C D Léze Pouzdro jehly Jehla s prostorem pro vzorek Proniknutí jehly do tkáně Posunem pouzdra přes jehlu dochází k odběru vzorku Vyjmutí jehly včetně pouzdra a vzorku Dysplazie střevní sliznice vodná fáze (NK) proteiny fenol/chloroform (lipidy) • Umístění buněk/tkání do extrakčního pufru • Dlouhodobé uchovávání (RNA later, chelatační činidla) Fenol/chloroformová extrakce a následně etanolová nebo isopropanolová precipitace Metody adsorpční Adsorpce NK na silikagel v přítomnosti chaotropních solí (guanidin isothiokyanát, NaI), eluce přes kolonky Metody vysolovací obchází použití organických rozpouštedel, při izolaci z krve nejprve hemolýza, následuje izolace DNA z leukocytů Izolace nukleových kyselin Koncentrace, kontrola čistoty a kvality DNA / RNA A260 = 1, c(dsDNA) = 50 μg/ml A260 = 1, c(ssDNA) = 33 μg/ml A260 = 1, c(ssRNA) = 40 g/ml A260/A280 v rozmezí 1,7 - 1,8 čistá DNA A260/A280 < 1,7 DNA znečištěná proteiny nebo organickými látkami A260/A280 > 1,9 DNA znečištěná RNA nebo organickými látkami A260/A280 = 1,9 – 2,1 čistá RNA A260/A280 < 1,9 RNA znečištěná proteiny nebo organickými látkami vzorekDNA restrikční štěpení Restrikční enzymy štěpí DNA na kratší fragmenty různé délky. DNA fragmenty jsou přeneseny do jamek gelu. Gel je umístěn mezi dvěmi elektrodami v eleketroforetické vaně, která je naplněna elektroforetickým pufrem. DNA fragmenty migrují v elektrickém poli ke kladně nabité anodě. Kratší fragmenty migrují v gelu snadněji a tedy rychleji oproti delším fragmenům a v časovém intervalu urazí v gelu větší vzdálenost. Gelová elektroforéza nukleových kyselin Další elektroforetické metody PFGE DGGE Kapilární elfo GAATTC CTTAAG GGGTTC CCCAAG dsDNA stejné velikosti A B Vzorek A Vzorek B Elektroforéza Vzrůstajícídenaturačnígradient. Vzorek A zpomalen denaturací Migracevgelu. A B Výsledek RNA/DNA Elektroforéza značený hmotnostní standard Elektroforéza roztok je kapilárními silami nasáván buničinou skrz gel a membránu Pufr membrána Buničina houba membrána DNA/RNA přenesená na membránu hybridizace se specifickou značenou sondou odmytí nenavázané sondy sonda hybridizovaná ke komplementárním sekvencím vizualizace Southernův přenos target DNA probe denaturation hybridization • Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) – Lokalizace vybraných nukleotidových sekvencí přímo v buňkách – Schopnost jednořetězcové sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle – TOP2A, EGFR, Her-2/neu TOP2A normál TOP2A rozsáhlá amplifikace Ca prsu • Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) – Lokalizace vybraných nukleotidových sekvencí přímo v buňkách – Schopnost jednořetězcové sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle – TOP2A, EGFR, Her-2/neu TOP2A norma TOP2A rozsáhlá amplifikace Ca prsu RNA sondy Nízkohustotní arrays AP- avidin Průkaz onkologických markerů pomocí DNAmikroaray testů Tato technika spočívá v umístění tisíců imobilizovaných DNA sekvencí oligonukleotidových značek v miniaturizovaném čipu. Povrchy jako je sklo nebo plast umožnily využít fluorescenční signály, zvýšení reproducibility a rychlosti hybr. kinetiky. Velmi zjednodušeně lze princip metody: Nejprve se izoluje vzorek DNA z buněk odebraných vyšetřované osobě a ten se označí fluorescenčním činidlem. Označená DNA se pak hybridizuje se vzorky určitých DNA sekvencí (DNA array) na destičce. Po promytí se měří fluorecence na „DNAarray“ a hodnotí pomocí počítače. •genová exprese •komparativní genomická hybridizace •SNP •sekvenace Současná hybridizace dvou vzorků DNA značených odlišnými fluorochromy na normální metafázní chromozomy DNA pacienta (nádorová) značena zeleně (FITC) kontrolní DNA (zdr. jedinec) značena červeně (TRITC) Komparativní genomová hybridizace Komparativní genomová hybridizace Genomová array CGH Výhody a nevýhody •není zapotřebí kultivace buněk • (použití interfázních chromozomů) •odhalí delece a amplifikace všech chromozomů buňky v jednom pokusu •možná diagnostika neznámé aberace •malé množství vzorku lze amplifikovat PCR •nelze zjistit balancované změny (translokace, inverze) •nelze odlišit diploidní a tetraploidní tumory •nelze vyšetřit změny v telomerických a v heterochromatinových pericentromerických oblastech •nutné aby alespoň 50% buněk neslo změnu 1. cyklus 2. cyklus dsDNA ssDNA denaturace annealing extenze denaturace annealing n. cyklus dsDNA primer 21 = 2 kopie 22 = 4 kopie 2n kopií ……………….. Princip PCR PCR umožňuje detekovat jediný leukocyt infikovaný HIV mezi 105 neinfikovaných bílých krvinek. K tomu je třeba onen jediný leukocyt, obsahující sekvenci typickou pro HIV, pomocí PCR rozmnožit. Při 30 PCR cyklech se původní počet cílových sekvencí znásobí 106 až 109. Vývoj PCR metod PCR Qualitative 1st 2nd 3rd Real-time PCR Relative Quantification Droplet Digital PCR Absolute Quantification Průběh qPCR Plateau fáze Lineární fáze Exponenciální fáze Absolutní kvantifikace KALIBRAČNÍ KŘIVKA Počet kopií (log N) 1 2 3 CT 30 20 10 Fluorescence CTR CTV CTK CT V případě relativní kvantifikace je nejdříve provedena normalizace a získána tak hodnota ∆CT definovaná jako ∆CT = CT V (cílový gen) – CTR (referenční gen). Následně je stanovena ∆∆CT jako: ∆∆CT = ∆CT V - ∆CT K (kontrolní vzorek). Relativní kvantifikace vzorku vzhledem ke kontrolnímu vzorku je získána umocněním 2-∆∆CT . Relativní kvantifikace Typy sond: 1. Nespecifické (např. interkalační barviva) 2. Specifické (fluorescenčně značené sondy) 3. Fluorescenčně značené primery A B Teplota Teplota 1 2 3 4 FRET 3 donorový fluorofor Amplifikovaná cílová DNA 5 akceptorový fluorofor Sonda 1 Sonda 2 Princip molekulárních majáků Amplikon Vlásenka Smyčka Fluorescence ZhášečReportér Stanovení mutací pomocí bi-funkčních molekul „scorpions“ Heterozygot CT CT CT Kvantifikace fluorescence pomocí qPCR Nasedání alelově specifckých primerů a extenze Denaturace a následné intramolekulární přeskupení oligonukleotidu Templát Alelově specifické „scorpions“ Ad 4) techniky založené na kvantifikaci DNA PCR s alelově-specifickými primery ARMS (Amplification Refractory Mutation System) v kombinaci se systémem „Scorpion“ Kolorektální karcinom, který patří k nejrozšířenějším nádorovým onemocněním v rozvinutých zemích, může být při velmi časné diagnóze úspěšně léčitelný (v lokalizovaném stadiu až 90 %). Existují genetické abnormality, které vedou nejprve k benigní proliferaci buněk sliznice tlustého střeva tj. k tvorbě polypů, dále pak adenomů a nakonec ke vzniku adenokarcinomu, popřípadě adenokarcinomu brzy metastazujícímu. Mutační analýza onkologických onemocnění Asi 1/3 populace mívá po padesátce adenomy tlustého střeva; ale jen u 10 % vznikne karcinom. Tyto adenomy možno klasifikovat podle jejich velikosti, patologie (makroskopická struktura) a dysplazie (mikroskopická struktura) na málo a na vysoce rizikové. Histopatologická kritéria nejsou však dostatečně objektivní. Mnohem lepší je průkaz mutace genu K-ras, který patří k protoonkogenům, uplatňujícím se v kaskádě transdukce signálu a je tedy částečně odpovědný za přeměnu adenomu na adenokarcinom. Mutace genu K-ras se většinou objevují v exonu 1, a to buď na kodónu 12 (GGT) nebo 13 (GGC). Oba triplety (GGT i GGC) kódují glycin. Vznikne-li mutace na jedné z obou bazí (kupř. GGT®GCT), pak v sekvenci polypeptidu je glycin nahrazen alaninem. Stanovení hladiny miRNA Reversní transkripce qPCR Princip HRM dsDNA maximální fluorescence Profil křivky tání u wt vzorku (100% párování) ssDNA (denaturovaná) minimální fluorescence Digitální PCR Make Droplets  Partition reagents and sample into 20,000 droplets PCR Droplets  Perform conventional PCR on thermal cycler Read Droplets  Quantify target nucleic acid by counting sample partitions with a positive PCR product (fluorescent) and a negative PCR product Results  Digital readout provides absolute measure of target DNA “X” target copies Siméon Denis Poisson (1781-1840) Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Low concentration High concentration NO targets Medium concentration Poisson corrected 38/143 Poisson corrected 96/143 Poisson corrected 6.2/143 Analýza exprese u onkologických onemocnění Rozdíl v expresních profilech zdravá x nádorová buňka Nejčastější markery: MGB1, CEA, CK20, EGFR1, C-MYC, TH, TS, … Detekce MRD Sekvencování Chemické (Maxam-Gilbetovo) sekvencování - příprava koncově značených jednořetězcových fragmentů - 4 paralelní vzorky – modifikace jednoho typu báze, kde je fragment štěpen Enzymatické (Sangerovo) sekvencování - Syntéza komplementárního vlákna k sekvenci kterou identifikujeme - 4 paralelní vzorky - do každého jeden dideoxyribonukleotid Pyrosekvencování Nová generace sekvencování (NGS) Výhody: • levnější a robustnější („high-throughput“) technologie (masivní paralelní sekvencování) • „high-throughput“ sekvencování umožňuje objev genů a regulačních elementů spojených např. se studovaným onemocněním • Cílené resekvencování – identifikace mutací • RNA sekvencování – analýza celého transkriptomu Limitace: • Značná pořizovací cena, relativně drahé analýzy pro menší rutinní laboratoře • Méně přesné čtení templátu (homopolymery), kratší délky sekvencovaných oblastí (cca 150-500 nukleotidů) • Náročná analýza dat NGS: postup DNA enrichment 454 Ion Torrent/Proton Illumina Porovnání jednotlivých přístupů Method Ion semiconductor (Ion Torrent sequencing) Pyrosequencing (454) Sequencing by synthesis (Illumina) Sequencing by ligation (SOLiD sequencing) Chain termination (Sanger sequencing) Read length up to 400 bp 700 bp 50 to 250 bp 50+35 or 50+50 bp 400 to 900 bp Accuracy 98% 99.9% 98% 99.9% 99.9% Reads per run up to 80 million 1 million up to 3 billion 1.2 to 1.4 billion N/A Time per run 2 hours 24 hours 1 to 10 days, depending upon sequencer and specified read length 1 to 2 weeks 20 minutes to 3 hours Cost per 1 million bases (in US$) $1 $10 $0.05 to $0.15 $0.13 $2400 Advantages Less expensive equipment. Fast. Long read size. Fast. Potential for high sequence yield, depending upon sequencer model and desired application. Low cost per base. Long individual reads. Useful for many applications. Disadvantages Homopolymer errors. Runs are expensive. Homopolymer errors. Equipment can be very expensive. Slower than other methods. Have issue sequencing palindromic sequence. More expensive and impractical for larger sequencing projects. DENATURACE (98 C) HYBRIDIZACE (98 C) LIGACE (54 C) PCR SEPARACE ds DNA ss DNA ss DNA F R Ligáza-65 použití univerzálních primerů inaktivace ligázy při 98 C fragmentová analýza Princip MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) A) NORMÁLNÍ HOMOZYGOT C) HETEROZYGOT B) DELETOVANÝ HOMOZYGOT 1 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 2 2 3 2 4 4 4 4 4 44 A B C 3 2 1 3 33 Detekce delecí Restrikční štěpení