Genová terapie
Petr Müller
Masarykův onkologický ústav
Genová terapie
=terapie využívající vpravení exogénni DNA do buněk či tkání organismu za účelem opravy fenotypu (deficience či mutace genu, vrozené či
získané choroby)
•klonování •expresní systémy •transfekce eukaryotických buněk •genová terapie v praxi
V běžné laboratoři se používá řada užitečných technik a postupů, které byli vyvinuty pro zdokonalení genové terapie
Klonování = vytváření identické kopie
Klonování v biologii
Klonování buněk
•selekce mutantů-klonovací kroužky •selekce hybridomů • klonování kmenových buněk
Klonování organismů
^^^^vegeiaíivnnozm nožová ní- říz ková ní •partenoc^^
•klonování zárodečných buněk •somatické klonování
Molecular cloning
Výběr plasmidu
expresní organismus
•bakterie •virus •eu kary ota
Selekce
bakterie: Ampicilin, Kanamycin,Spectinomycin,
Chloramphenicol, Doxyciclin, Rifampicin
eukarvota: Geneticin, Blasticidin, Zeocin, Puromycin...
Promotor
virový, inducibilní, tkáňově specifický
Struktura genu, mRNA
Vektory pro genovou terapii
•DNA
•lineární DNA •plasmidová DNA
• Viry
•Adenovirus
•Adeno associated virus
•Retroviry=MMLV, HIV=Lentivirus
•Herpesvirus
o
G)
	*—'	■—'	■—'			
		fr	*			
	c	Ui				
1—1	-					
+	-i		~—i			
k		to	4—<			
	•*■	1-	T N			
	■/!'	'/1	1 1			
	LJ	Cj				
	■ I	■ i				
<.'■•						
a						
						
	43	v	-	■	l	
		r	:	r	•	l
						
	■:		o	■:■		
		*	■*	H.		
		:■	■:■	■:■	■:	
■:	n	n		n	ľ	ľ
-f						rH
■:■						
ľ						
rH						
		L"'	-1-	r-.		•T'
■ :■	«	.	■ o			
+			U-1	U-1		U"'
r-	r			.3-.		
■-■						
u-	r-*				-H	-H
■~	—i				-H	-H
		9	-	_	■ň	
=	:	=	=	=	=	-
	j.		Q.		a.	
-JĽ		SL	j;		-ji	a;
■■■■III
o
CM
"D
O
> 03
Q.
(0 "D
C % O Q.
S
0
> O
c
o
CD
CD
	-ŕ			L"-1	■1	f-
-T						
*						
	;	■í-	■ v	■:■		;■
		■j	■j	■■j		Jil
u'						
=						
—	—			—	—	=
=	—			■ =	=	■
n		i	I	t:	n	
			X.	x.		
Enhancer Bazální l promotoři ^
—r—v
Promotor
%
\
X
y
mRNA
Snaha o uvedení genové terapie v praxi probíhá paralelně s výzkumem regulace genové exprese
Požadavky na dobrý vektor
Regulace genové exprese
•Správné začlenění do genomu •Dlouhodobá exprese •Tkáňově specifická exprese •Optimální dávka
•Export m RNA z jádra do cytoplasmy •Poločas rozpadu mRNA •Úspěšné zahájení translace
RNA pol II regulated micro RNAi
In vivo versus ex vivo
Vysoká okamžitá exprese Distribuce ve všech tkáních
Imunitní odpověď Náhodné začlenění
o o
+
Cílená tkáň Optimální exprese
Omezená distribuce buněk
Choroby potenciálně léčitelné genovou terapií
I
Chybějící sérové proteiny
Hemofilie-faktorVIII, IX Wilsonova choroba- Ceruloplasmin
Metabolické choroby
Deficience ornitin dekarboxylázy
Svalové dystrofie
Poruchy imunitního systému
SCID-ADA deficience, X=linked... Další choroby s Mendelovskou dědičností
Cystická fibróza
Malignity
Solidní nádory Leukémie, Lymfomy
Neurodegenerativní choroby
Alzheimer- agregace Tau Huntingtonova choroba Parkinsonova choroba
Multifaktoriální choroby
Kardiovaskulární choroby Oční choroby
o o
2 o
0 c
c >
d) o
N *ť
1 i
5 »ô
Kompenzace poruchy, regulace
Virové vektory:
většinou neschopné replikace (crippled)
Lentivirus (HIV)
Reverzní transkriptáza
Tranzientní transfekce (lipofekce, elektroporace)
Produkcrrf
VSV-virus vesikulární stomatitidy
VSV-G
Neurony infikované rekombinantním VSV nesoucím gen pro GFP
's/
Cytomegalovirus Woodchuck hepatitis virus Bakteriofág M13 SV40 HIV
'3/1
Normal celJ
No functional p53 Viral replication Cell destruction,
virus release, virus spread
Figure 1: Selective Effect ol ON YX-015 on p53-Delicient Cells—The adenovirus 0NYX-Q15 is under development Id treat Jumors lacking p53 function:, Hyposhetically, cancer cells lacking junctional p53 would be sensiliwe to wal replication and subsequent cytopathic effects.
Transfekce samotné DNA
•Lipofekce •Elektroporace •Dendrimery •Polymery (PEG) •Gene gun
Elektroporace
The phenomenon of el et t rop u rati o n
Cell membrane
Cell membrgne during puling
Cell mcm&njnc after puiting feed frtumi ta
Lipofekce
Ceil membrane Nucleus
Lysosome
Li pop I ex-mediated transfection and endocytosis
Expert Reviews in Molecular Medicine©2003 Cambridge University Press
Dendrimery
CO,Me
large excess (15-250:1)
MeOH
Me02C
leOH
HNOC
NU;
PAMAM (polyamidoamine)
xonhI
/
Ucntintlon	GO	Ol	G2	G3	i-; G4
id Surface Croups			12	24	40
		1.3	Ä.*	3.*	
:j'J- i:-?-" H c-prci rntitlDn	Y				©
WChimfcil			*		
Komplex DNA-dendrimer
Gene gun
Before
Screw- n retainers
Screftn
Sfock wave
Helium oas
Restraining mernbrariB
Kapton disc
Mieraprojecldes Stopping •••
After
^3 ^
T SEJŮ
Etické aspekty
•Klonování zárodečných kmenových buněk a jejich použití pro genovou terapii •Definice nemoci, normality •Zneužití, doping