Nové trendy ve výzkumu mikroRNA u solidních nádorů Ondřej Slabý Masarykův onkologický ústav Středoevropský technologický institut, Masarykova univerzita logo_MOU © George Calin, Hui Ling a Wei Zhang (převzato z obálky Chinese J Cancer 2011, 30:11) D:\CURRENT DOCS\2012\October 2012\BIOBANKS\JSCO\star-trek-original-cast-i-mudd.jpg Moderní technologie, individualizace léčby a bioetika z pohledu Star Treku Kapitán Kirk Dr. McCoy zvaný Bones neboli kostra Kapitán Kirk: Doktore, potřebuji urychleně vědět jestli tento Aleuviánský velvyslanec bude nebo nebude žít. Dr.McCoy: Jimme, jsem jen prostý venkovský lékař, analýza celého genomu mi pár minut potrvá. Dr. McCoy: OK, už je to tady. Můj trikodér na obrazovce DNA skeneru ukazuje v genomu pacienta cizorodou DNA sekvenci. Jimme, tento muž má Vulkánskou enecefalitickou horečku! Pro Aleuviány je fatální. Kapitán Kirk: Sakra, Bonesi (přezdívka dr. McCoye). Tento muž musí žít nebo veškerá vyjednávání zkrachují. Dr. McCoy: Analyzuji jeho DNA sekvenci v Lékařských databázích a srovnávám sekvenci jeho viru s dostupnými antivirotiky. Ano, už je to tady. Existuje jeden lék, který by mu mohl pomoci, ale neodvažuji se mu ho podat. Nepodám mu ho bez jeho souhlasu. V jeho DNA se vykytují podivné sekvence. Neznám význam těchto adeninových oblastí a nemohu predikovat reakci na léčbu. TATO NUKLEOTIDOVÁ TERAPIE HO VYLÉČÍ NEBO ZABIJE. Pacient se musí rozhodnout sám. Kapitán Kirk: Proklatě Bonesi, riskujeme mezigalaktickou válku! Dr. McCoy: Kapitáne, jsem lékař, dal jsem přísahu neublížit. Nebudu pokračovat bez souhlasu pacienta nebo dalších genomických vyšetření. kódující geny představují méně než 2% celkové sekvence genomu vs. minimálně 90% lidského genomu je aktivně transkribováno čím více je organizmus komplexní, tím více obsahuje nekódujících RNA Svět nekódujících RNA Sana et al, J Transl Med, 2012 Sana et al, J Transl Med, 2012 Nové třídy nekódujících RNA HISTORIE 1993 Ambros, Ruvkun – objev miRNA lin-4 1998 Fire, Mello – popis RNA interference 1999 Tuschl, Zamore, Bartel, Sharp -RNAi 21-23 fragmenty 2000-2001 Hannon -Ago2, Dicer 2002 Zamore RNAi a miRNA sdílejí svoji efektorovou dráhu 2002 Croce, Calin miR-15,miR-16 u CLL První práce popisující zapojené mikroRNA do procesu maligní transformace! Cell, 1993 Nature, 1998 George Calin (scientometrie z “mikroRNA let” 2003-2013) H-index – 64 ,celkový počet citací bez autocitací 22152 2007 První originální práce na téma miRNA v onkologii v ČR h-index 63, citaci 24000 Croce- 146, 80000 Současnost ambros.JPG Victor Ambros 2012, CSHL © O. Slabý 23.4.2013, 07.05 microRNA = 22113 microRNA AND cancer = 8950 © Slaby, Svoboda et al. MikroRNA v onkologii, Galen, 2012 SOUČASNOST Postavení mikroRNA v centrálním dogmatu molekulární biologie DNA mRNA protein Post-transkripční regulace genové exprese mikroRNA inhibice translace, degradace mRNA Transkipční úroveň regulace genové exprese Transkripce Translace Reverzní transkripce Francis Crick, 1956 David Baltimore, 1970 Replikace MALIGNÍ TRANSFORMACE Úvod do molekulární medicíny 4/12 Strana 29 © Ondřej Slabý, 2009 Základní fakta o mikroRNA •Přibližně 3% predikovaných lidských genů jsou geny pro miRNA •Jsou fylogeneticky vysoce konzervované •Geny pro miRNA jsou rozmístěny na všech lidských chromozomech s výjimkou Y •V databázi miRBase je anotováno 1390 mikroRNA*(1000 -2000 predikovaných) •Maturovaná miRNA je dlouhá 20-25 nukleotidů •MiRNA mají potenciál regulovat více než polovinu lidských kódujících genů •Jedna miRNA může regulovat desítky až stovky cílových mRNA •miRNA často tvoří rodiny nebo jsou kódovány v klastrech (eg. cluster miR-17) *Sanger miRBase release 17.0, 2011 Kanonický model biogeneze a funkce mikroRNA DESTABILIZACE mRNA!!! Pokles hladiny proteinových produktů cílových genů je ve více než 80% způsoben poklesem hladin mRNA v důsledku jejích destabilizace a nikoliv translační represí. (využití RPF) Guo, Bartel, Nature, 2010 DESTABILIZACE REPRESE REPRESE deadenylace Biologický poločas a rozpad mikroRNA Kai S, Nature Struct. Mol. Biol. 2010 MiRNA obecně představují vysoce stabilní molekuly, poločas miRNA v buněčných liniích nebo orgánech dosahuje mnoho hodin nebo dokonce i dnů! MiRNA mohou být regulované například blokováním jejich vazebných míst na mRNA pomocí RNA-vazebných proteinů. Volné miRNA jsou méně stabilní. IzomiRs Neilsen, Trends in Genetics, 2012 •Poprvé popsány v roce 2008 na základě výsledků sekvenačních studií (Morin et al., 2008, Genome Res) •Jedna oblast kódující miRNA může vést ke vzniku mnoha rozdílných izomiRs. •Zastoupení jednotlivých izomiRs je tkáňově specifické a může se měnit v rámci odpovědi na různé biologické signály. •Vznik 5’ a 3’ izomiRs je podmíněn štěpením Droshou a Dicerem nebo účinkem transferáz. •Polymorfní izomiRs mohou vznikat v důsledku SNP (vzácné) nebo editací mikroRNA (A-I). Funkční dopady: specificita pro cílové mRNA, Ago loading, biologický poločas MikroRNA jako onkogeny nebo nádorové supresory Lujambio, Nature 2012 Kong et al, Lancet Oncology 2012 Kasinsky, Slack, Nature Reviews Cancer, 2012 MikroRNA jako onkogeny nebo TS v závislosti na buněčném kontextu MikroRNA v patogenezi nádorových onemocnění MikroRNA jsou zapojeny do regulace všech šesti klasických a čtyř nových získaných znaků maligního nádoru dle Weinberga a Hanahana. (Hallmarks of Cancer: The Next Generation, Cell, 2011) Slaby et al., Galen, 2012 MikroRNA a autofagie Slaby et al., Galen, 2012 MikroRNA se podílejí na regulaci klíčových procesů autofagie, jako jsou signalizace mTOR, skládání komplexu ULK1, interaktom proteinu Beclin-1 nebo ATG4 signalizace. MikroRNA a nádorové kmenové buňky Slaby et al., Galen, 2012 MikroRNA jsou zapojeny do regulace klíčových signálních drah regulujících kmenové vlastnosti nádorových kmenových buněk. mikroRNA nepodléhají degradačním procesům během formalínové fixace a archivace v parafinových blocích jako je tomu u mRNA èARCHIVY FFPE MATERIÁLU NA PATOLOGIÍCH JE TAK MOŽNÉ VYUŽÍVAT PRO ROZSÁHLE RETROSPEKTIVNÍ STUDIE > > > versus mikroRNA z FFPE mRNA z FFPE Yaguang Xi, RNA, 2007, 13:1–7 > MikroRNA jako tkáňové biomarkery MikroRNA jako biomarkery v onkologii Slaby et al., Galen, 2012 Prognostický biomarker Příklad tkáňové mikroRNA u renálního karcinomu Diagnostický biomarker Příklad sérových mikroRNA u renálního karcinomu SNP ve vazebných místech pro miRNA u CRC SNP a mikroRNA, rizikové faktory 1.SNPs v biogenetické dráze miRNA 2.SNPs v sekvenci pri, pre a maturované miRNA 3.SNPs ve vazebných oblastech pro miRNA G/A ITGB4 (miR-34a) Brendle et al, Carcinogenesis 2009 Slaby et al., J Cell Mol Med, 2011 SNP a mikroRNA SNP ve vazebných místech pro miRNA regulované chemoprotektanty Slaby et al., Nutrition and Cancer, 2013 Weber et al., Clin Chem, 2010 Cirkulující mikroRNA jsou přítomny ve dvanácti typech tělních tekutin Gilad et al.,PLoS ONE, 2008 Stabilita cirkulujících mikroRNA Původ cirkulujících mikroRNA Redova, Slaby, Future Oncology 2013 Cirkukující sérové mikroRNA v diagnostice renálního karcinomu Vzorky krevního séra rozdělené do skupin na základě rozdílné exprese miRNA (žlutá barva znamená vzorky pacientů s renálním karcinomem, modrá pak vzorky kontrolních jedinců, vyhodnoceno metodou LIMMA, p<0001) Redova et al., J Transl Med 2012 Vzorky pacientů Vzorky kontrol é ê Škála hladin mikroRNA Cirkulující sérové mikroRNA v diagnostice renálního karcinomu miR-451 miR-378 AUC=0.772 AUC=0.71 AUC=0.857 miR-451 & miR-378 ROC Senzitivita=81% Specificita=83% N=90 N=35 N=90 N=35 Redova et al., J Transl Med 2012 Močové mikroRNA jako diagnostické biomarkery uroteliálního karcinomu Yamada et al. Cancer Science, 2010 nepublikovaná data, 2013 MikroRNA jako prognostické tkáňové biomarkery u renální karcinomu Predikce časného relapsu po nefrektomii u pacientů s renálním karcinomem Slaby et al, Genes Chromosomes and Cancer, 2012 Pacienti s RCC Časný relaps Špatná prognóza Bez relapsu Dobrá prognóza ? Stejný režim sledování, stejná léčba Intenzivnější sledování, intenzivnější léčba Méně intenzivní sledování, méně zatěžující léčba MikroRNA jako prognostické tkáňové biomarkery u renální karcinomu Predikce časného relapsu po nefrektomii u pacientů s renálním karcinomem Slaby et al, Genes Chromosomes and Cancer, 2012 miR-126 é ê 80% 40% MikroRNA jako prediktivní biomarkery odpovědi na anti-EGFR terapii u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem anti-EGFR therapy cetuximab In collaboration with University of Ferrara (prof. Negrini lab) miR-X a miR-X Time to progression (month) Time to progression (month) Overall survival (month) Overall survival (month) MikroRNA jako prediktivní biomarkery odpovědi na anti-EGFR terapii u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem miR-X miR-X miR-X miR-X MikroRNA jako terapeutické cíle Wurdinger et al., Pharmacogenomics J, 2008 Iorio et al., EMBO Mol Med, 2012 Nádorově supresorová mikroRNA Substituční terapie Faltejskova et al.,J Cell Mol Med 2012 Funkční in vitro analýza mikroRNA deregulovaných u kolorektálního karcinomu Jaká je funkce miR-215 v buňkách kolorektálního karcinomu? HCT-116+/+ HCT-116-/- SW-620 HT-29 DLD-1 BC.jpg apo.jpg scratch.jpg MTT.jpg EP TT miR-215 – – – – – § § § § § § P = 0.0168 P = 0.0122 P = 0.0273 In vitro funkční analýza miR-215 u kolorektálního karcinomu: ovlivnění proliferace P = 0.005 P = 0.01 P = 0.05 In vitro funkční analýza miR-215 u kolorektálního karcinomu: ovlivnění apoptózy a buněčného cyklu ↓ 50% Identification and functional screening of microRNAs highly deregulated in colorectal cancer P. Faltejskova, M. Svoboda, K. Srutova, et al. J Cell Mol Med, 2012 §Experimentální potvrzení predikovaných cílových genů miR-215 (ZEB1, ZEB2). §Validace pozorování získaných in vitro na in vivo myším modelu §Vývoj nanočástic (železité nanočástice konjugované s chitosanem) jako delivery systému pro podání terapeutických miRNA in vivo mouse.jpg In vitro funkční analýza miR-215 u kolorektálního karcinomu: ovlivnění migrační schopnosti nádových buněk MikroRNA jako terapeutické cíle Seznam mikroRNA které jsou testovány jako potenciální terapeutické cíle MicroRNAs as therapeutic targets Miravirsen, anti-miR-122 MikroRNA jako terapeutické cíle: from bench to bedside MRX34 – hepatocelulární karcinom doc. RNDr. Ondřej Slabý, PhD postdocs Mgr. Martina Rédová, PhD MUDr. Marek Svoboda, PhD MUDr. Julie Bienertová-Vašků, PhD Nithyananda Thorenoor, PhD PhD studenti Mgr. Renata Héžová Mgr. Jiří Šána Mgr. Petra Faltejsková Mgr. Hana Mlčochová Mgr. Robert Iliev Mgr. Zbyněk Čech Mgr. Jana Merhautová Mgr. Andrej Bešše Mgr. Jitka Mlčochová Mgr. Jaroslav Juráček Pregraduální studenti Bc. Anna Čurdová Bc. Renata Kleinová Bc. Zdeňka Kosařová Bc. Soňa Klusová Bc. Zuzana Ožanová Poděkování CEITEC, Skupina Molekulární onkologie II logo_MOU