Dvourozměrná elektroforéza: analýza hladin denitrifikačních proteinů u bakterie Paracoccus denitrificans Pavel Bouchal Laboratoř proteomiky Ústav biochemie PřF MU 2-D proteinová mapa 99747^1 W7 ^. V mf. . k/ P47755 rvvi7M pft67; Pfr31C- ** Q06H30 ■ P30«M PO05O5 P1253E P(WŮ7S POMOC O033B- Z179« a1^36513 P5ÍŮĚ1 JP15531 4 * * á T^PM-HI - * Ol 5540 30 4.5 5.0 20 jQDHBa OOB765 10 6.0 i 70 8.0 9.5 Langen H. etal.: 2-DE map of human brain proteins. Electrophoresis 20, 907 (1999) Príprava vzorku pro 2-DE Desintegrace biologických vzorků buněk, tkáně Sonikace, French-press, osmotická či enzymatická lýze!!!!! Inhibice proteas (PMSF, Pefabloc™, Complete™)!! (rostliny!!!!) Inhibice fosfatas (Na2V03, NaF)! Odstranění nukleových kyselin (DNAsa I, benzonasa)!!! Odstranění dalších interferujících látek (polysacharidy, fenolické I.)! Nízká iontová síla (10 mM soli)!!!! Precipitace vzorku (zakoncentrování, delipidace): aceton, trichloroctová kyselina Solubilizace vzorku, pak centrifugace (-16000 g, 20 min, 4°C) Solubilizace vzorku • CHAOTROPNI ČINIDLA omezují vodíkové vazby a elektrostatické interakce 7 M močovina, 2 M thiomočovina • DETERGENTY obalují hydrofobní části bílkovin a tím zvyšují jejich rozpustnost 2-4% CHAPS nebo 1% AS B 14 nebo 1% C7BzO; 0,5-1% TRITON X-100 • REDUKČNÍ ČINIDLA štěpí disulfidické vazby -S-S- mezi cysteiny 50-100 m M dithiothreitol • AMFOLYTY pufrují pH a také zlepšují rozpustnost proteinů Pharmalyte, Bio-Lyte, Ampholyte (2%) Protokol pro prípravu vzorku -sklizení buněk 5000 g, 30 min, 4 C -promytí 50 mM Tris/HCI pH 7.3, supernatant odlít -k peletu přidat lyzační pufr (7M močovina, 4% thiomočovina, 1% C7BzO, 70 mM DTT, 2% Pharmalyte 3/10, proteasové a fosfatasové inhibitory) -desintegrace ultrazvukem 60 x 0.1 s -solubilizace 1 h/lab T -centrifugace 16000 g/20 min/4 °C -stanovení bílkoviny -150 jig proteinu precipitovat 7,5 (obj.) násobkem acetonu 1,5 h / -20°C -centrifugace 16000 g/20 min/4 °C -resolubilizace peletu v rehydratačním pufru (7M močovina, 2M thiomočovina, 1% C7BzO, 70 mM DTT, 2% Pharmalyte 3/10) -nanesení na IPG strip Bouchal P. Zdráhal Z., Helánová Š., Janiczek O., Hallberg K.B., Mandl M., Proteomics 2006, 6, 4278-4285 1. rozměr: isoelektrická fokusace (IEF) Separace podle pl. Počítají se volthodiny (Vh) • IPG-IEF (proužky s imobilizovaným pH gradientem) -dobrá re p rod u kováte I n ost, napětí až 10000 V, současný standard, komerčně dostupné pH gradient 3-10 NL (gradienty existují v úzkém rozsahu i jedné jednotky pH) Dávkování vzorku: in-gel rehydratace 2. rozměr: SDS-PAGE • Ekvilibrace IPG proužků před SDS-PAGE: obalení proteinů SDS -(uděluje proteinům uniformní náboj na jednotku hmotnosti), krok 1: redukce (DTT) krok 2: alkylace (jodacetamid) • SDS-PAGE (malý formát) 12% (homogenní) Mr 15000-100000 • Pufrový systém: tris-glycin-SDS (=„Laemmli") Aparatury na SDS-PAGE Barvení gelů relat. citlivost • Stříbrem: analytické (problémy s MS!) + + + • Coomassie brilliant blue (mikropreparativní) + koloidníCBB + + • SYPRO Ruby/Orange -fluorescenční + + (+) (analyt.+mikroprep.) • detekce na filmu - autoradiografie + + + (analyt., inkorporace značeného izotopu během biosyntézy proteinů) • DIGE (diferenční gelová elektroforéza) + + (+) (fluorescenční obarvení 2 vzorků před 2-DE analýzou, všechny vzorky v 1 gelu, vizualizace: 3 různé X (jedna referenční)) Obrazová analýza 2-DE gelů • Odečtení pozadí a detekce spotů • Manuální kontrola a korekce detekovaných spotů • Vzájemné přiřazování odpovídajících si spotů na různých gelech v jedné sadě (matchsetu) - MATCHING • Kvantitativní a statistická analýza dat • Tvorba obrazových 2-D databází PDQUEST (Bio-Rad) IMAGE MASTER (Amersham Biosciences) MELANIE (Geneva Bioinformatics) PHORETIX 2-D / AIDA (Nonlinear Dynamics) Možnosti identifikace proteinů • Peptide mass fingerprinting (MALDI-TOF MS) • Částečná sekvenace peptidů (MALDI-TOF MS/MS, LC-MS/MS) L> srovnání s databází (NCBI, Swiss-Prot/TrEMBL) • Western-blotting + imunochemická detekce (protilátky) Webová 2-DE databáze Paracoccus denitrificans http://web.mpiib-berlin.mpg.de/cgi-bin/pdbs/2d-page/extern/menu_frame. cgi?gel=20