Vizualizace makromolekul při elektroforetické separaci
Fluorescenční značení lze využít při sledování elektroforetické migrace makromolekul.
V případě, že jsou protein a DNA naznačeny rozdílnou fluorescenční značkou, lze
nezávisle detekovat polohu DNA a proteinů a sledovat jejich vzájemnou interakci.
Materiál
 DNA fragment s navázanou fluorescenční značkou Rhodamin Red X (excitace
572 nm, emise 595 nm)
 protein s navázanou fluorescenční značkou Alexa Fluor 488 (excitace 496 nm,
emise 519 nm)
 roztok akrylamidu 30% (akrylamid : bisakrylamid ~ 37:1)
Upozornění: Akrylamid je neurotoxin. Je nutno pracovat v rukavicích!
 5X TBE (450 mM Tris, 450 mM kys. boritá, 10 mM EDTA)
 30% APS (ammonium persulfate)
 TEMED (N, N, N´-tetramethylethylendiamin)
 Fosfátový pufr (50 mM NaCl, 50 mM fosfát sodný)
 ddH2O
 n-butanol nasycený vodou (45 ml n-butanolu smíchaný s 5 ml ddH2O)
 mikrozkumavky
 6x nanášecí pufr (0.15% orange G, 60% glycerol, 10 mM Tris-HCl pH 7.6,
60 mM EDTA)
 aparatura pro horizontální elektroforézu
 fluorescenční scanner FLA-7000
Postup
1. Připravte směs pro horizontální akrylamidový gel tak, že smícháte odpovídající
množství zásobního roztoku akrylamidu (neurotoxin!), 5X TBE a ddH2O, aby
výsledná koncentrace akrylamidu byla 5 % v 0.25X TBE a celkový objem směsi
byl 80 ml.
Jednotlivé složky přidávejte v pořadí:
ddH2O, 5x TBE, dále 400 µl 30% APS a 26,4 µl TEMED a až nakonec 30%
akrylamid. Dobře promíchejte, nalijte do formy a nasaďte hřebínek na 10 jamek.
Směs se po nalití do formy přelije vrstvou n-butanolu, aby mohlo dojít
k polymeraci bez přístupu vzduchu. Nechte 1 hodinu polymerizovat na stole.
2. Připravte roztok fluorescenčně značené DNA ve fosfátovém pufru tak, aby byla
jeho výsledná koncentrace 1,5 pmol/µl (zásobní DNA: vysušených 30 pmol)
3. Ze zásobního roztoku protein o koncentraci 3,6 pmol/µl odeberte 10 µl (do
mikrozkumavky číslo 9).
Připravte roztok fluorescenčně značeného proteinu ve fosfátovém pufru tak, aby
byla jeho koncentrace 3 pmol/µl.
4. Připravte vzorky do mikrozkumavek podle následující tabulky bez přídavku
nanášecího pufru:
zkumavka číslo: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pouze
DNA
DNA : protein pouze
protein
1:2 1:4 1:6 1:8 1:12 1:16 1:20 1:24
DNA (1,5 pmol/μl) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 protein
(3 pmol/μl) - 1 2 3 4 6 8 10 10* 1
fosfátový pufr 14 13 12 11 10 8 6 4 4 14
6x nanášecí pufr 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
* ze zásobního roztoku proteinu o koncentraci 3,6 pmol/μl
5. Nechte 10 minut inkubovat za laboratorní teploty.
6. Sestavte aparaturu pro horizontální elektroforézu a naplňte ji 0.25X TBE pufrem
(cca 1,5 l).
7. Ke každému vzorku přidejte 6x nanášecí pufr podle tabulky.
8. Vložte gel do elektroforetické vany.
9. Naneste vzorky na gel v pořadí jako je v tabulce.
10. Spusťte elektroforézu při napětí 40 V. Po 30 minutách zvyšte napětí na 80 V a
nechte pokračovat dalších 60 minut.
11. Detekujte fluorescenci značené DNA na fluorescenčním scanneru s nastavením
budícího záření a detekčního filtru na Rhodamin red-x [ROX].
12. Detekujte fluorescenci značeného proteinu na fluorescenčním scanneru s
nastavením budícího záření a detekčního filtru na Alexa fluor [FITC].
13. Porovnejte obě výsledná zobrazení a určete oblasti, ve kterých se vyskytují
komplexy vzniklé vazbou proteinu na DNA.
Obr. 1 Příklad překryvu zobrazení při různém fluorescenčním značení DNA a proteinu