Vizualizace makromolekul při elektroforetické separaci
Fluorescenční značení lze využít při sledování elektroforetické migrace makromolekul.
V případě, že jsou protein a DNA naznačeny rozdílnou fluorescenční značkou, lze
nezávisle detekovat polohu DNA a proteinů a sledovat jejich vzájemnou interakci.
Materiál
! DNA fragment s navázanou fluorescenční značkou (EXmax=572 nm,
EMmax=595 nm)
! protein s navázanou fluorescenční značkou (EXmax=494 nm, EMmax=519 nm)
! roztok akrylamidu 30% (akrylamid : bisakrylamid ~ 37:1)
Upozornění: Akrylamid je neurotoxin. Je nutno pracovat v rukavicích!
! 5X TBE (450 mM Tris, 450 mM kys. boritá, 10 mM EDTA)
! 30% APS (ammonium persulfate)
! TEMED (N, N, N´-tetramethylethylendiamin)
! pufr B (20 mM Hepes, 150 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5% glycerol, 0,1% Tween-20)
! ddH2O
! N-butanol nasycený vodou (45 ml N-butanolu smíchaný s 5 ml ddH2O)
! mikrozkumavky
! 6x nanášecí pufr (0.15% orange G, 60% glycerol, 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 60 mM
EDTA)
! aparatura pro horizontální elektroforézu
! fluorescenční scanner FLA-7000
Postup
1. Připravte směs pro horizontální akrylamidový gel tak, že smícháte odpovídající
množství zásobního roztoku akrylamidu (neurotoxin!), 5X TBE a ddH2O, aby
výsledná koncentrace akrylamidu byla 5 % v 0.25X TBE a celkový objem směsi byl
80 ml. Jednotlivé složky přidávejte v pořadí ddH2O, 5x TBE, přidejte 400 l 30%
APS a 26,4 l TEMED a nakonec 30% akrylamid. Dobře promíchejte, nalijte do
formy a nasaďte hřebínek na 10 jamek. Směs se po nalití do formy přelije vrstvou
n-butanolu, aby mohlo dojít k polymeraci bez přístupu vzduchu. Nechte 1 hodinu
polymerizovat na stole.
2. Připravte zásobní roztok fluorescenčně značené DNA v pufru B tak, aby byla jeho
koncentrace 0,5 pmol/l.
3. Připravte zásobí roztok fluorescenčně značeného proteinu v pufru B tak, aby byla
jeho koncentrace 4 pmol/l.
4. Připravte vzorky do mikrozkumavek podle následující tabulky bez přídavku
nanášecího pufru:
DNA:protein
(vše v l)
pouze
DNA
1:2 1:8 1:12 1:16 1:20 1:24 1:28 1:32
pouze
protein
DNA (0,5 pmol/l) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 protein
(4 pmol/l) - 0,5 2 3 4 5 6 7 8 5
pufr B 8 7,5 6 5 4 3 2 1 - 5
6x nanášecí pufr 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
5. Nechte 10 minut inkubovat za laboratorní teploty.
6. Sestavte aparaturu pro horizontální elektroforézu a naplňte ji 0.25X TBE pufrem.
7. Ke každému vzorku přidejte 1/5 celkového objemu 6x nanášecího pufru podle
tabulky.
8. Vložte gel do elektroforetické vany.
9. Naneste vzorky na gel v pořadí jako je v tabulce.
10.Spusťte elektroforézu při napětí 40 V. Po 30 minutách zvyšte napětí na 80 V a
nechte pokračovat dalších 60 minut.
11.Detekujte fluorescenci značené DNA na fluorescenčním scanneru s nastavením
budícího záření a detekčního filtru na rhodamin red-x [ROX].
12.Detekujte fluorescenci značeného proteinu na fluorescenčním scanneru
s nastavením budícího záření a detekčního filtru na alexa fluor [Alexa 488].
13.Porovnejte obě výsledná zobrazení a určete oblasti, ve kterých se vyskytují
komplexy vzniklé vazbou proteinu na DNA.
Obr. 1. Příklad překryvu zobrazení při různém fluorescenčním značení DNA a proteinu