Fluorescenční značení proteinu
Fluorescenční značení proteinu bude provedeno za použití
soupravy Alexa Fluor 594 Protein Labeling Kit. Proteiny
značené tímto fluoroforem vykazují excitační maximum 590
nm a emisní maximum 617 nm. Alexa Fluor 594 je ve formě
NHS (sukcinimidyl) esteru viz Obr. 1. Za použití následujícího
postupu lze fluorescenčně naznačit 0.1 až 1 mg proteinu.
Obr. 1 AlexaFluor 594
Příprava proteinu
Pro optimální efektivitu značení by měl být protein ve fosfátovém pufru bez amonných inontů a
primárních aminů. V případě, že protein je v jiném pufru (Trisový, glycinový), je možno dialýzou
pufr změnit.
Výsledná koncentrace roztoku proteinu na značení by měla být 2 mg/mL.
Materiál
 Alexa Fluor 594
 Mikrozkumavka s magnetickým míchadlem
 Roztok proteinu ve fosfátovém pufru (Thyroglobulin, MW = 669 000, extinkční koeficient
ε = 353465 M-1
cm-1
, zásobní koncentrace 10 mg/ml)
 1M roztok hydrogenuhličitanu sodného (NaHCO3, MW = 84), 1ml
 Fosfátový pufr (50 mM NaCl, 50 mM fosfát sodný)
 Kolona s náplní Sephadex G-25
Značení proteinu
1. Do mikrokyvety napipetujte 50 µl roztoku proteinu (c= 10 mg/ml).
Jestliže je koncentrace proteinu vyšší než 2 mg/ml, roztok se naředí přidáním fosfátového
pufru na výslednou koncentraci 2 mg/ml.
2. (Zkumavku s fluorescenční značkou nechte zahřát na laboratorní teplotu. Přidejte 100 µl
1M NaHCO3 a promíchejte pipetováním nahoru a dolů.)
Odpipetujte 50 µl roztoku fluorescenční barvičky do mikrozkumavky s proteinem a
promíchejte pipetováním nahoru a dolů.
3. Vše nechte míchat v mikrozkumavce s magentickým míchadlem po dobu 30 minut při
laboratorní teplotě.
4. 5-10 minut před koncem inkubace připravte kolonu pro separaci proteinu a nenavázané
fluorescenční značky.
Purifikace proteinu
Náplň kolony Sephadex G-25 umožňuje gelovou filtrací oddělit nenavázanou fluorescenční
značku od proteinu podle rozdílné velikosti a molekulové hmotnosti.
1. Kolonu umístěte do stojánku, odstraňte víčko a zátku a nechte
obsah kolony vykapat.
2. Promyjte kolonu 5 ml fofátového pufru.
3. Opatrně naneste reakční směs proteinu a značky pipetou do středu
kolony. Použijte 100 µl fosfátového pufru k vypláchnutí mikrozkumavky
s reakční směsí a opět naneste na kolonu. Roztok nechte zaputovat do kolony.
4. Po 1 ml přidávejte fosfátový pufr.
Postupně jímejte frakce vytékající z kolony do mikrozkumavek po 1 ml.
Po cca 2-3 ml začíná vytékat značený protein. Zachyťte značený protein
do jedné frakce.
5. Vzorek (frakci se zachyceným značeným proteinem) proměřte na spektrofotometru.
Na základě absorpčního spektra určete, jaké množství proteinu bylo naznačeno a jaký je
stupeň značení.
Nastavení spektrofotometrů:
NanoDrop:
Functions – Wave scan – interval vlnových délek (260-600 nm) – vložte kyvetu s blankem –
Blank – vložte kyvetu se vzorkem – Sample
Options – Graph scale – upravit rozsah osy y, aby byly píky viditelné
Helios:
Scan – Start (260 nm) – Stop (600 nm) – Bandwidth (2 nm) – Blank – vložte kyvetu s blankem –
Zero base – vložte kyvetu se vzorkem – Run
Manipulate – Track
molární množství značky ku molárnímu množství proteinu =
A590 × ředění
73000 × Cm
kde 73000 je molární extinkční koeficient značky Alexa Fluor 594 při 590 nm a Cm molární koncentrace proteinu