Fluorescenční značení proteinu Fluorescenční značení proteinu bude provedeno za použití soupravy Alexa Fluor 594 Protein Labeling Kit. Proteiny značené tímto fluoroforem vykazují excitační maximum 590 nm a emisní maximum 617 nm. Alexa Fluor 594 je ve formě NHS (sukcinimidyl) esteru viz Obr. 1. Za použití následujícího postupu lze fluorescenčně naznačit 0.1 až 1 mg proteinu. Obr. 1 AlexaFluor 594 Příprava proteinu Pro optimální efektivitu značení by měl být protein ve fosfátovém pufru bez amonných inontů a primárních aminů. V případě, že protein je v jiném pufru (Trisový, glycinový), je možno dialýzou pufr změnit. Výsledná koncentrace roztoku proteinu na značení by měla být 2 mg/mL. Materiál • Alexa Fluor 594 • Mikrozkumavka s magnetickým míchadlem • Roztok proteinu ve fosfátovém pufru (Thyroglobulin, MW = 669 000, extinkční koeficient ε = 353465 M-1 cm-1 , zásobní koncentrace 10 mg/ml) • 1M roztok hydrogenuhličitanu sodného (NaHCO3, MW = 84), 1ml • Fosfátový pufr (50 mM NaCl, 50 mM fosfát sodný) • Kolona s náplní Sephadex G-25 • Kyvety • NanoPhotometer (Implen) Značení proteinu 1. Do mikrokyvety napipetujte 50 µl roztoku proteinu (c= 10 mg/ml). Jestliže je koncentrace proteinu vyšší než 2 mg/ml, roztok se naředí přidáním fosfátového pufru na výslednou koncentraci 2 mg/ml. 2. Zkumavku s fluorescenční značkou nechte zahřát na laboratorní teplotu. Přidejte 25 µl 1M NaHCO3 a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. Odpipetujte do mikrozkumavky s proteinem a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. 3. Vše nechte míchat v mikrozkumavce s magnetickým míchadlem po dobu 30 minut při laboratorní teplotě. 4. 5-10 minut před koncem inkubace připravte kolonu pro separaci proteinu a nenavázané fluorescenční značky. Purifikace proteinu Náplň kolony Sephadex G-25 umožňuje gelovou filtrací oddělit nenavázanou fluorescenční značku od proteinu podle rozdílné velikosti a molekulové hmotnosti. 1. Kolonu umístěte do stojánku, odstraňte víčko a zátku a nechte obsah kolony vykapat. 2. Promyjte kolonu 5 ml fofátového pufru. 3. Opatrně naneste reakční směs proteinu a značky pipetou do středu kolony. Použijte 100 µl fosfátového pufru k vypláchnutí mikrozkumavky s reakční směsí a opět naneste na kolonu. Roztok nechte zaputovat do kolony. 4. Po 1 ml přidávejte fosfátový pufr. Postupně jímejte frakce vytékající z kolony do mikrozkumavek po 1 ml. Po cca 2-3 ml začíná vytékat značený protein. Zachyťte značený protein do jedné frakce. 5. Vzorek (frakci se zachyceným značeným proteinem) proměřte na spektrofotometru. Na základě absorpčního spektra určete, jaké množství proteinu bylo naznačeno a jaký je stupeň značení. Nastavení spektrofotometru: Functions – Wave scan – interval vlnových délek (260-600 nm) – vložte kyvetu s blankem – Blank – vložte kyvetu se vzorkem – Sample Options – Graph scale – upravit rozsah osy y, aby byly píky viditelné kde 73000 je molární extinkční koeficient značky Alexa Fluor 594 při 590 nm a Cm molární koncentrace proteinu, (ředění: pokud jste ředili do kyvety) Výsledky Získané množství proteinu a stupeň značení.