Fluorescenční stanovení koncentrace DNA
Určení koncentrace DNA je často základním krokem při analýze biologického materiálu
a je součástí mnoha laboratorních protokolů. Znalost přesné koncentrace DNA je důležitá
pro celou řadu technik (např. sekvenování, klonování cDNA, transkripce RNA).
Koncentrace DNA je nejčastěji měřena UV spektroskopií, určením hodnoty absorbance
při 260 nm (Abs260 = 1 pro dvouřetězcovou DNA o koncentraci 50 µg/mL; v kyvetě
o optické dráze 1 cm).
Ke kvantifikaci nižších koncentrací DNA, než jsou detekovatelné za použití UV
spektroskopie lze použít fluorescenční sondy, které se vážou na dvouřetězcovou DNA a
vykazují několikanásobný nárůst intenzity fluorescence po navázání. K sondám, které lze
použít ke stanovení koncentrace DNA patří GelStar. Tato fluorescenční sonda má
excitační maximum kolem 493 nm a emituje v oblasti 530 nm.
Materiál
Spektrofluorometr
SpectroVis Plus (Vernier)
Kyveta (2 mL)
Roztok DNA (Salmon
sperm)
GelStar (10000x)
1x TE pufr
Destilovaná voda
Příprava roztoků
1x TE:
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA
pH 8,0
100x GelStar
2 µl zásobního koncentrovaného roztoku GelStar nařeďte na objem 200 µl pufrem
1x TE
Standardní roztok DNA
Abs260 = 0,387
koncentrace = ?
Vytvoření standardní křivky
1. Připravte vždy 1ml roztoku DNA v 1X TE postupným ředěním o koncentracích:
5 ng/µl, 2.5 ng/µl, 1.25 ng/µl, 0.625 ng/µl, 0.3125 ng/µl.
2. Připravte blank: 1 mL 1x TE pufru
3. Ke každé koncentraci 1mL standardního roztoku DNA a k blanku přidejte vždy
20 µ l 100x ředěného zásobního GelStar roztoku a 980 µ l 1xTE pufru.
Promíchejte a postupně pipetujte do kyvety. Celková koncentrace DNA
standardů v kyvetě je nyní poloviční (2.50, 1.25, . . . 0.16 ng/µl)
4. Všechny standardy a vzorky s GelStar uchovejte v temnu až do měření.
5. Zapněte spektrofluorometr podle návodu.
6. Spusťte program Logger Pro 3.8.2
7. Změřte intenzitu fluorescence
Experiment – Change units – Spectrometer – Fluorescence – excitační vlnová
délka
8. Změřte nejdříve intenzitu fluorescence blanku, následně standardy:
vložte kyvetu, měření spustíte tlačítkem Collect a zastavíte Stop
9. Hodnoty intenzity zapište do tabulky a vyneste do grafu hodnoty intenzity
fluorescence standardů na koncentraci vzorku.
Měření neznámého vzorku
1. Nařeďte neznámý vzorek v 1x TE na celkový objem 1mL. Objem vzorku
v mikrozkumavce: 0.5 ml
2. Přidejte 20 µl 100x GelStar a 980 µl 1xTE pufru.
3. Změřte intenzitu fluorescence neznámého vzorku.
4. Určete podle standardní křivky koncentraci DNA v neznámém vzorku.
Výsledky
Stanovení koncentrace DNA v původním neředěném neznámém vzorku.