Vlastní fluorescence proteinů
Vlastní fluorescenci proteinů je způsobena aromatickými aminokyselinami v nich
obsaženými: tryptofanem (Trp), tyrozinem (Tyr) a fenylalaninem (Phe). Dominující je
fluorescence tryptofanu, naopak prakticky vůbec se neuplatňuje fenylalanin. V této úloze
jsou změřena fluorescenční excitační a emisní spektra albuminu a čistého tryptofanu,
tyrozinu a fenylalaninu.
Vlastnosti L-tryptofanu
 MW = 204,23
 absorpční maximum: λexmax = 295 nm
 fluorescenční emisní maximum: λemmax = 353 nm
 emise Trp je vysoce závislá na polaritě a okolním prostředí
Vlastnosti L-tyrozinu
 MW = 181,19
 absorpční maximum: λexmax = 275 nm
 fluorescenční emisní maximum: λemmax = 304 nm
 emise Tyr je relativně málo citlivá na polaritu rozpouštědla
Vlastnosti L-fenylalaninu
 MW = 165,19
 absorpční maximum: λexmax = 260 nm
 fluorescenční emisní maximum: λemmax = 282 nm
 emise Phe je strukturovaná
Fluorescence proteinů je obvykle excitována při 280 nm nebo při delších vlnových
délkách, takže fenylalanin není ve většině experimentů excitován. Navíc je kvantový
výtěžek fluorescence Phe velmi malý (kolem 0,02). Tryptofanovou fluorescenci v
proteinech lze selektivně excitovat při 295-305 nm.
Materiál
 L-tryptofan (Applichem), L-tyrozin (Applichem), L-fenylalanin (Applichem)
 Hovězí sérový albumin (BSA, MW = 67000)
 pufr A (120 mmol/l NaCl, 10 mmol/l KCl, 30 mmol/l Tris HCl, pH 7,4)
Postup
1. Připravené zásobní roztoky Trp, Tyr, Phe a BSA nařeďte pufrem A pomocí tabulky:
zásobní
koncentrace
1. ředění 1. počet ředění
(např. 100x)
2. ředění
(do 1500 μl)
2. počet
ředění
Trp 10 mM 5 μM 100 nM
Tyr 2 mM 20 μM 143 nM
Phe 10 mM 16,66 μM ------- -------
BSA 0,3 mM 0,6 μM 30 nM
Intenzitafluorescence
Intenzitafluorescence
2. Změřte excitační a emisní spektra vzorků za podmínek uvedených v tabulce.
excitační spektrum emisní spektrum
λem (nm) λex (nm) λex (nm) λem (nm)
L-tryptofan 350 240-300 280 290-420
L-tyrozin 300 240-290 270 280-450
L-fenylalanin 280 240-270 250 260-360
albumin 350 240-320 280 300-420
Výsledky
Změřená excitační a emisní spektra vlastní fluorescence tryptofanu (Trp), tyrozinu (Tyr),
fenylalaninu (Phe) a albuminu v pufru A jsou na Obr.1 a Obr 2. Z výsledných spekter je
zřejmé, že prakticky veškerá vlastní fluorescence albuminu pochází od tryptofanu. Měření
byla provedena na spektrofluorometru FluoroMax-4.
1.2x10
6
1.0x10
6
8.0x10
5
TRP
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
5
0.0
PHE
ALB
TYR
240 260 280 300 320
(nm )
Obr. 1 Excitační spektra 5 μM Trp (λem = 350 nm), 20 μM Tyr (λem = 300 nm),
200 μM Phe (λem = 280 nm) a 0.6 μM albuminu (λem = 350 nm).
1.2x10
6
1.0x10
6 ALB
TRP
8.0x10
5
6.0x10
5
PHE
TYR
4.0x10
5
2.0x10
5
0.0
250 300 350 400
(nm )
Obr. 2 Emisní spektra 5 μM Trp (λex = 280 nm), 20 μM Tyr (λex = 270 nm),
200 μM Phe (λex = 250 nm) a 0.6 μM albuminu (λex = 280 nm).