Fluorescenční značení proteinu Fluorescenční značení proteinu bude provedeno za použití soupravy Alexa Fluor 594 Protein Labeling Kit. Proteiny značené tímto fluoroforem vykazují excitační maximum 590 nm a emisní maximum 617 nm. Alexa Fluor 594 je ve formě NHS (sukcinimidyl) esteru viz Obr. 1. Za použití následujícího postupu lze fluorescenčně naznačit 0.1 až 1 mg proteinu. Obr. 1 Alexa Fluor 594 Příprava proteinu Pro optimální efektivitu značení by měl být protein ve fosfátovém pufru bez amonných inontů a primárních aminů. V případě, že protein je v jiném pufru (Trisový, glycinový), je možno dialýzou pufr změnit. Výsledná koncentrace roztoku proteinu na značení by měla být 2 mg/mL. Materiál  Alexa Fluor 594  Mikrozkumavka s magnetickým míchadlem  Roztok proteinu ve fosfátovém pufru (TRF2, MW = 59 135, ε = 50545 M-1 cm-1 , zásobní koncentrace 4.5 mg/ml)  1M roztok hydrogenuhličitanu sodného (NaHCO3, MW = 84), 1ml  Fosfátový pufr (50 mM NaCl, 50 mM fosfát sodný)  Kolona s náplní Sephadex G-25  Kyvety  NanoPhotometer (Implen) Značení proteinu 1. Do mikrokyvety napipetujte 166 µl roztoku proteinu (c= 4.5 mg/ml). Roztok nařeďte přidáním fosfátového pufru na výslednou koncentraci 2 mg/ml. 2. Zkumavky s fluorescenční značkou nechte zahřát na laboratorní teplotu. Přidejte 40 µl 1M NaHCO3 do každé zkumavky a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. Odpipetujte roztok fluroforu do mikrozkumavky s proteinem a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. 3. Vše nechte míchat v mikrozkumavce s magnetickým míchadlem po dobu 30 minut při laboratorní teplotě. 4. 5-10 minut před koncem inkubace připravte kolonu pro separaci proteinu a nenavázané fluorescenční značky. Purifikace proteinu Náplň kolony Sephadex G-25 umožňuje gelovou filtrací oddělit nenavázanou fluorescenční značku od proteinu podle rozdílné velikosti a molekulové hmotnosti. 1. Kolonu umístěte do stojánku, odstraňte víčko a zátku a nechte obsah kolony vykapat. 2. Promyjte kolonu 5 ml fofátového pufru. 3. Opatrně naneste reakční směs proteinu a značky pipetou do středu kolony. Použijte 100 µl fosfátového pufru k vypláchnutí mikrozkumavky s reakční směsí a opět naneste na kolonu. Roztok nechte zaputovat do kolony. 4. Po 1 ml přidávejte fosfátový pufr. Postupně jímejte frakce vytékající z kolony do mikrozkumavek po 1 ml. Po cca 2-3 ml začíná vytékat značený protein. Zachyťte značený protein do jedné frakce. 5. Vzorek (frakci se zachyceným značeným proteinem) proměřte na spektrofotometru. Na základě absorpčního spektra určete, jaké množství proteinu bylo naznačeno a jaký je stupeň značení. Nastavení spektrofotometru: Functions – Wave scan – interval vlnových délek (260-600 nm) – vložte kyvetu s blankem – Blank – vložte kyvetu se vzorkem – Sample Options – Graph scale – upravit rozsah osy y, aby byla maxima spektra dobře viditelná Určení koncentrace proteinu v mg/ mL Aprotein = A280 – A594*CF CF = A280 volné značky A594volné značky ; CF je korekční faktor udávající příspěvek značky k absorpčnímu spektru Výpočet stupně značení proteinu stupeň značení = A594 × MW𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 c 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 × ε594 𝑠𝑡. 𝑧𝑛𝑎č𝑒𝑛í = 𝑚𝑜𝑙á𝑟𝑛í 𝑚𝑛𝑜ž𝑠𝑡𝑣í 𝑧𝑛𝑎č𝑘𝑦 𝑚𝑜𝑙á𝑟𝑛í 𝑚𝑛𝑜ž𝑠𝑡𝑣í 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑢 = 𝑘𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒 𝑧𝑛𝑎č𝑘𝑦 𝑘𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑢 = 𝐴594 𝜀594 𝑐 𝑝𝑟𝑜𝑡 𝑀𝑊𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 kde ε594 = 73000 je molární extinkční koeficient značky Alexa Fluor 594 při 594 nm, c je koncentrace proteinu v mg/mLa MW je molekulová hmotnost proteinu Výsledky Získané množství proteinu a stupeň značení.