Souhrn 4. přednášky •Analytické/diagnostické metody •Genetické metody –Plasmidy –Integrace • • Osnova 5. přednášky •Genetické metody –mutageneze/“screen“ –komplementace –identifikace •Buněčný cyklus –Průběh a regulace BC –Synchronizace buněk –mechanismy regulace párování –Homothalické kmeny • • • • Mutace genu -Studium funkce genu – fenotyp (1. delece, 2. mutace) - životaschopné – mutace lze přímo integrovat do genomu - mutantní kmeny se testují na citlivost k různým „toxinům“ – dále je lze křížit s funkčně podobnými geny-mutantami a hledat jejich funkční vztahy (synthetic lethal x epistatic x suprese) - esenciální gen => buňky potřebují gen např. na plasmidu (plasmid shuffling) 2. krok Plasmid shuffling Pokud je YFG1 esenciální musí být v deleční mutantě přítomna extra divoká kopie genu např. na plasmidu Na dalším plasmidu může být vnesena mutovaná verze yfg1 – její efekt se projeví až po odstranění plasmidu s divokou kopií genu (pomocí FOA - přeměňována Ura3p dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil => URA3+ buňky nerostou, zatímco ura3- buňky jsou resistentní) Podobně lze použít ade2, ade3 (S.c.) nebo ade6 (S.p.) systémy s YFG1 wt genem na plasmidu - s ADE3 (kolonie jsou červené díky ade2 mutaci) – po ztrátě plasmidu jsou sektory kolonii bílé (bez Ade3p enzymu je metabolická dráha blokována dříve než vzniká červený metabolit) Tetrádová analýzy (potvrzení letálního fenotypu) Pokud je YFG1 esenciální musí být v deleční mutantě přítomna extra divoká kopie genu např. na plasmidu Na dalším plasmidu může být vnesena mutovaná verze yfg1 – její efekt se projeví až po odstranění plasmidu s divokou kopií genu (pomocí FOA - přeměňována Ura3p dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil => URA3+ buňky nerostou, zatímco ura3- buňky jsou resistentní) Podobně lze použít ade2, ade3 (S.c.) nebo ade6 (S.p.) systémy s YFG1 wt genem na plasmidu - s ADE3 (kolonie jsou červené díky ade2 mutaci) – po ztrátě plasmidu jsou sektory kolonii bílé (bez Ade3p enzymu je metabolická dráha blokována dříve než vzniká červený metabolit) Tetrádová analýzy (potvrzení letálního fenotypu) Plasmid shuffling Křížení – ověření - jedna mutace, meioticky defekt - rozdělení do komplementačních skupin (allelická kompl.) Kontrola závislosti na plasmidu na FOA plotnách Ověření pravosti (mutant+delece) X supresor na plasmidu Izolace mutant Počet mutací •Studium metabolických drah (URA, GAL …) •… flokulace, aglutinace (FLO, AGA …) •… sekrece, endocytózy, morfogeneze (SEC, END … ORB) •… mechanismu párování (STE …) •… vlivu záření na buňky … rad mutanty (např. RAD21, RAD50, RAD51) •… buněčného cyklu (CDC …) • • 220px-Exercise_Desert_Rock_I_%28Buster-Jangle_Dog%29_002 1mM HU.tif ředící řada Ben-Aroya et al, Mol Cell, 2008 ts mutanty ts mutanty jsou výhodné pro studium funkce (esenciálního) genu – mutanty jsou normální na permisivní teplotě (25°C), ale za restriktivní teploty (37°C) nemohou dokončit buněčný proces vyžadující aktivní protein Diploidní heterozygotní kmeny z EuroFan projektu specifické „barcodes“ pro každý gen ts mutanty ts mutanty = většinou nestabilní proteiny, které se při zvýšené teplotě denaturují/ztrácí aktivitu a jsou degradovány Dohmen et al.: Science, 1994 - ubiquitinace „označkuje“proteiny pro proteasom (degradaci) - ts alela DHFR je degradována (nestabilní protein – strukturní mutace) - fůze DHFR (ts alely) s heterologním proteinem => celý protein je na 37°C degradován - je možné využít pro přípravu ts mutantních kvasinek (fůze s CDC28 – kvasinky arestují v G1 fázi) Haruki et al, Mol Cell, 2008 - ke studiu terminálního fenotypu je třeba rychlé deaktivace proteinu (plasmid shuffling nebo vypínání promotoru je pomalé) – kromě ts mutant byla vyvinuta nová technologie na odstranění proteinu ze správného místa (např. z jádra do cytoplasmy) má stejný efekt jako jeho deaktivace (není použitelné pro všechny proteiny) - - kotva (PMA1 na membráně nebo ribosomální HTB2 rychle přechází do cytoplasmy a tvoří ribosomy) po přidání rapamycinu „odtáhne“ cílový protein Životní cyklus S. cerevisiae 800px-Yeast_lifecycle - Deleci či mutaci lze provést v haploidní či diploidní buňce - - v haploidní buňce hrozí suprese defektu proto je lépe používat diploidní buňky (druhá kopie zůstává nezměněná) - - lze připravit dvojitého mutanta křížením haploidních mutant a poté sporulací diploida - pouzdro spory je třeba rozrušit a pomocí mikromanipulátoru získat jednotlivé haploidní buňky (lze provést i tzv. random sporulation) - u S.pombe jsou diploidní buňky nestálé a okamžitě sporulují (pouzdro se rozpadá samo) Tetrádová analýza 800px-Yeast_lifecycle YPD Selektivní médium (SD-ura ... testy) Segregace 2:2 A A a a a a A A a A a A . . . Tetrádová analýza – syntetická letalita 800px-Yeast_lifecycle Brc1D + 254 WT 52 a 53 Tetrády 254xNBI231(Brc1).tif 54 a 55 Tetrády 254xNBI231(Brc1).tif Brc1D + 254 WT 254 Brc1D WT + 254 + WT Brc1D Syntetická letalita-screen - křížení s knihovnou mutant (delečních) nebo další mutageneze mutanty Forsburg: NRG, 2001 Forsburg: NRG, 2001 28°.tif 3HU.tif wild-type Rhp51D R254E double vyřazení dráhy může pomoci pokud chyba (downstream) v této dráze je příčinou problémů - mutace téhož genu „napraví“ původní mutaci -mutace sousedního (protein) zesílí oslabenou interakci - nadprodukce proteinu z paralelní dráhy - nadprodukce proteinu z téže dráhy Suprese Nobelova cena za výzkum buněčného cyklu v roce 2001 - - Leland Hartwell začala studovat buněčný cyklus v 60.letech na S. cerevisiae. Podařilo se jí izolovat kvasinky, které měly mutovaný gen kontrolující buněčný cyklus. V následujících letech identifikovala podobným způsobem více než 100 genů kontrolujících buněčný cyklus (např. CDC28). Také sledovala citlivost kvasinek na poškození DNA radiací. Zjistila, že BC je při poškození DNA zastaven – aby získal čas na opravu DNA Paul Nurse studoval buněčný cyklus na S. pombe. V 70. letech objevil gen cdc2, který je zodpovědný za regulaci většiny fází BC. V roce 1987 izoloval homologní lidský gen a nazval jej CDK1 (cyclin dependent kinase). Tim Hunt na začátku 80. let objevil první cyklin – cykliny jsou proteiny, které jsou syntetizovány a odbourávány během určité části buněčného cyklu. Cykliny se váží na CDK a regulují jejich aktivitu. Buněčný cyklus S. pombe - nestálé diploidní buňky vstupují do meiosy hned po konjugaci - pro konjugaci je kritická G1 fáze jako u S. cerevisiae S.pombe má rovnocenné dělení - vznikají buňky stejné velikosti – hned vstupují do S fáze (jsou dostatečně velké) – pro vstup do mitozy musí být dvojnásobná velikost (kontrola v G2 fázi => nejdelší je G2 fáze) … Nurse, JCB, 1995 - mutagenese S. pombe – hledání ts mutant (55 000 kolonii) s defektní morfologií – našli 64 kmenů (3 druhy defektu: 51 kulatých=orb, 8 tip elongation aberrant=tea, 5 banana=ban) - z 51 orb mutant křížených s WT segregovalo 43 v poměru 2:2 tj. jeden gen (8 sterilních), „linkage analysis“ mezi mutantami ukázala 12 orb genů (skupin – Tab.I) ... aktinový cytoskelet (polarizovaný růstu) Buněčný cyklus S. cerevisiae -zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze -rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze -jádro se protahuje – začátek M fáze (mitózy) -oddělení pupene – cytokineze – přechod z M do G1 -Oddělená dceřinná buňka je menší než mateřská – nerovnocenné dělení– pro další dělení musí dosáhnout určité velikosti => dlouhá G1 fáze Curr Opin Gen Dev 5 (1995) - Více v dalších přednáškách •Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division cycle“ mutanty) •Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků charakteristických pro určitou fázi buněčného cyklu Klíčovým mezníkem BC u S. cerevisiae je START, kdy se rozhoduje o přechodu z G1 do S fáze: - pro další dělení musí buňka v G1 fázi dosáhnout určité velikosti - haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují - diploidní buňky (při nedostatku N a C) zastavují v G1 a zahajují sporulaci - při vyčerpání živin z média přechází z G1 do stacionární fáze - nedostatek dusíku – růst pseudohyf - STARTovní interval lze rozdělit na úsek A a B - v úseku A se rozhoduje o přechodu do stacionární fáze (mutanty zastavené v této fázi nemohou konjugovat) - v úseku B se rozhoduje o konjugaci či sporulaci (zastavení pomocí alfa-faktoru, nemůže být zvolena alternativa přechodu do stacionární fáze) - v úseku A hrají roli CDC25 a CDC35 (komponenty RAS dráhy) - pro úsek B (a další „checkpoints“) je klíčový CDC28 (tj. CDK1) a příslušné cykliny A B Synchronizace S. cerevisiae buněk 800px-Yeast_lifecycle - v úseku A jsou buňky „nedorostlé“ – elutriace (centrifugace dle velikosti buněk) – tzv. G0 synchronizace - v úseku B se rozhoduje o konjugaci - za přítomnosti alfa-faktoru dochází k zastavení buněčného cyklu – G1 synchronizace - HU inhibuje syntézu nukleotidů potřebných pro replikaci – synchronizace v S fázi - nocodazol blokuje polymeraci tubulinu – schází mikrotubuly pro mitózu – G2 synchronizace - ts mutanty různých CDC genů – různé fáze buněčného cyklu G1-A G1-B G1 Párování S. cerevisiae Diploid Fůze jader konjugace Chant, Curr Opin in Cell Biol, 1996 Vybudování buněčné stěny přemosťující „shmoo“ výběžky Signální dráha – a faktor Wang et al., Nature, 2004 Cdc28 Zastavení buněčného cyklu Aktivace transkripce Morfologické změny (aktin) Funkce jednotlivých proteinů v průběhu párování/matingu Ren et al., Science, 2000 KAR1 chrIII Chromosom III obsahuje: - MAT lokus - MAT a (HMR) kazeta - MAT a (HML) kazeta - HML a HMR jsou tiché alely (heterochromatin) - Co a1, a2 + a1, a2 kódují? (transkripční faktory) HO endonukleasa – výměna kazet v MAT lokusu (rozeznává specifické sekvence) Heterothalické – stabilní Homothalické – přepínají párovací typ Chromosom III Přepínaní párovacího typu HML HMR MAT CEN Široký šikmo dolů a Široký šikmo nahoru a Široký šikmo dolů a Široký šikmo nahoru a Široký šikmo dolů a Široký šikmo nahoru a a1, a2 a1, a2 a1 a1 Chromosom III HO-endonukleasa Genová konverse HO endonukleasa rozeznává a štípe specifické sekvence Používá se pro vygenerování DSB a studium mechanismů opravy poškozené DNA umlčená kopie umlčená kopie Přepínání párovacího typu DNA z MAT lokusu je HO endonukleasou vystřižena a na její místo se překopíruje sekvence z kazety opačného páru - HO endonukleasa je exprimována pouze v mateřské buňce v G1 fázi (dceřinná si uchová původní typ) Current Opinion in Cell Biol 8 (1996) homothalické Příprava aneuploidních buněk KAR1 gen potřebný pro karyogamii tj. pro fuzi jader a::HIS3 + a::kanMX => rezistence pouze v (a) haploidních buňkách Studium vlivu aneuploidie na buňku (u člověka se podílí na kancerogenezi, aneuploidie v 90% lidských nádorů) Torres et al, Science, 2007 19.9.2013 10-11.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Úvod – historie, význam 26.9.2013 10-11.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Základní charakteristiky kvasinek 3.10.2013 10-11.50hod A2-2.11 Mgr. J. Kopecka Kvasinky a biotechnologie 10.10.2013 10-11.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Genetické a molekulárně biologické metody 17.10.2013 10-11.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Morfologie a buněčný cyklus, párovací proces, 24.10.2013 10-11.50hod A7-2.14 prof. M. Kopecká O podstatě buněčných stěn kvasinek 31.10.2013 11-12hod A2-2.11 Dr. Převorovský Od transkripčních faktorů ke zkráceným chromozomům 7.11.2013 10-11.50hod A2-2.11 prof. Svoboda Sekreční dráhy a endocytóza, protoplasty kvasinek jako modelový objekt 14.11.2013 10-11.50hod A2-2.11 prof. Svoboda Patogenní kvasinky, morfologická charakteristika, medicínské aspekty 21.11.2013 10-11.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Regulace transkripce, 1-2-3 hybridní systémy, reporter systémy 28.11.2013 10-11.50hod A2-2.11 Dr. Kolesár Využití kvasinek pro studium procesů opravy DNA 5.12.2013 8-12hod A7-2.14 prof. Svoboda+Doc.Paleček Cvičení k přednášce 12.12.2013 10-11.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Organizce chromatinu ??? 19.12.2013 9-11hod A2-2.11 Doc. Paleček Zkouška Rozvrh přednášek