CG020 Genomika BÍ7201 Základy genomiky Přednáška 4 Genetika přímá Jan Hejátko Funkční genomika a proteomika rostlin, Mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin, Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno hejatko(5?sci. muni.cz, www.ceitec.muni.cz INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky ^^^^^^^m ^^^^m ■ MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, «id*ié»Éni V EVROPSKÁ UNIE 90^0 ■ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pmto,kui«n«iohi.pn«« <4hav*' Osnova ■ Přímá vs. reverzní genetika ■ Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky ■ vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle ■ anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu metabolického profilu ■ exprese zajímavých genů ■ identifikace mutovaného lokusu ■ plasmid rescue ■ iPCR ■ Využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice ■ poziční klonování NVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ MLÁDEŽE A TELOVÝCHOVY Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky Osnova ■ Přímá vs. reverzní genetika INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Přístupy „klasické"genetiky versus „reverzně genetický' přístup ve funkční genomice NÁHODNÁ MUTAGENEZE \ „Přímě genetickv"přístup EMS T-DNA 1. IDENTIFIKACE FENOTYPU 2. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ 3. GENOVÁ IDENTIFIKACE -pozični klonovanl „Reverzně geneticky" přístup 1.IZOLACE SEKVENČNĚ SPECIFICKÉHO MUTANTA 2. IDENTIFIKACE FENOTYPU 3. PRŮKAZ KAUZÁLNÍ SOUVISLOSTI (retro)transposons MEZI INZERCÍ A FENOTYPEM EVROPSKÁ UNIE INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Osnova Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky ■ vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle ■ anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Inzerční mutageneze v přímé genetice Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze Infekce EuMyc myší retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které vznikly díky aktivaci Pim kináz (ve 40% aktivaci Pim1 a v 15% aktivaci Pim2), molekulární cíle těchto kináz byly neznámé Pimf Pírtí. V 9 100 Mikkers et al, Nature Gen (2002J Inzerční mutageneze v přímé genetice Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze Infekce EpMyc pim1 mutantů retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které obsahují v 90% inzerci v blízkosti (aktivaci) Pim2 Pimf Pírtí. V 9 100 Mikkers et al, Nature Gen (2002J Inzerční mutageneze v přímé genetice Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze Infekce E^Myc dvojnásobných mutaníů pim1, pim2 retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, u kterých lze očekávat aktivaci buď některého ze signálních partnerů Pim proteinů (Y), některého z proteinů Pim signální dráhy (X) nebo k aktivaci některé z příbuzných drah vedoucích k lymfomagenezi (Z) a E\iMyc h E\MfC Pirn1J- Pimí ma 5wň Pim: US Mikkers et aL Narture Gen (2002) Inzerční mutageneze v přímé genetice Izolace genomových oblastí přilehajících k místu inzerce proviru a Štěpení genomové DNA a ligace speciálních linkerů, tzv. splinkerett (zvýšení specifity amplifikace) lurtiúr DNA resiritteil vÁlh enzyme X is ligaied ta rhe S |l lili kl'l I'll E- SpUnkereBt PCA willi (irsl Divan e1 al.. Nud Ae-íd Res (1994) r Mikkers et al.. Nature Gen (2002) Inzerční mutageneze v přímé genetice ■ Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce proviru Mikkers et al.. Naturs Gen (2002) Inzerční mutageneze v přímé genetice ■ Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce proviru Mikkers et al.. Naturs Gen (2002) Inzerční mutageneze v přímé genetice Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce proviru Sekvenace a lokalizace oblastí přiléhajících k protoviru vyhledáváním v anotovaných databázích myšího genomu SpliiikereHt Devan e1 aL Nud Ae-id Res (1994) Mikkers et al.. Nátuře Gen (2002) liiriiui DNA reslriCtĚli wilh enzyme X is lili jisii lů tne splínkerEne Osnova metabolického profilu INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Metabolické profilování Metabolické profilování rostlin hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů 73 1S. 329 min ll 1,1 1245 i> ll jíIl. k Lij ion wrw SOrmn Metabolické profilování ■ Metabolické profilování rostlin hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů identifikace {např. i komerčně) zajímavých mutantů Vector2 I Col-Ž WT Metabolické profilování Metabolické profilování rostlin hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů identifikace {např. i komerčně) zajímavých mutantů snadná a rychlá izolace genů pomocí identifikace T-DNA zasažených sekvencí Metabolické profilování Metabolické profilování rostlin možnost využít i speciální techniky, např. mikrodisekce Cryosectioning LMPC Sections without vascular bundles (,( MS Sali IídJ Cluster analysis of cell-type specific samples Identification of differentially concentrated metabolites Osnova ■ exprese zajímavých genů INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Expresní profil ■ Identifikace mutantů se změnou expresního profilu analýza expresního profilu (vzorce) daného genu a identifikace mutantů se změnou exprese Expresní profil ■ Identifikace mutantů se změnou expresního profilu analýza expresního profilu (vzorce) daného genu a Expresní profil Osnova ■ identifikace mutovaného lokusu ■ plasmid rescue ■ iPCR INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Identifikace mutovaného lokusu ■ Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis ■ popis fenotypu INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Identifikace mutanta Identifikace mutanta I samčí sterilita, poruchy v prodlužování tyčinek (A,B) (porovnej se standardním typem C) Identifikace mutovaného lokusu ■ Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis ■ popis fenotypu ■ identifikace T-DNA mutované oblasti INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Identifikace mutovaného lokusu 1. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k levé hranici pomocí plasmid rescue ■ reštrikční štěpení (EcoRt) mutantní genomové DNA ■ religace a transformace E.coli ■ izolace plazmidové DNA z pozitivně selektovaných klonů ■ identifikovaná sekvence byla identická s genem pro NAD7 kódovaným na mtDNA PpulDI ľ n CACAGGAAACAGCT AIGACATGATTACCAAtlCGrGC i CGG1ACC.CAATT CTATGAAAGAG ľCTCGGGAGCCAGGATGCA7GCCA GT TIC AT ACGACCAGGT GGAG TGGCACAAGAT CIGCCTCľľGGCTTAlGTCGAGAIAIIGAT T CC GTGTCĽTTTGTCGATACTGTACTAATGCTTAAGC TCGAGCCŮTGGGTTAA GATAC íTTCTCAGAGCCCTCGGICCTACGTACGGT CAMGľATGC TGGTCCACCTCACCGTGTTC IA G AC G G AG A AC CGAATACAGCTC1ATAACTAAGG TICACACAACAATTTGCTTCTCGTATCGATGAAT TAGAAGAGATGTC AAC CGGCAACCGT ATCTGGA.AACAACGAITAGTGGATA TTGGTACTGT CACTGCACAGtAAGCAAAGGATTGGGGAATTGTAAATGGCTTCATGTC CGGGGGA AAGTGIGTTGTTAAACGAAGAGCATAGCTACTTAATC ITCJCTACAGITGGCCGIľGGCATAGACCTTTGTTGCTAATGACCIATAACGAIGACAGTGACGTGTCGT1CGTTTGCIAACCCĽTTAACATTTAGCGAAGTACAGGCCGCCI -nad7 sequence - 27 Identifikace mutovaného lokusu 2. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k pravé hranici pomocí inverzní PCR (iPCR) reštrikční štěpení (EcoRI) mutantní genomové DNA purifikace, religace a PCR pomocí T-DNA specifických primerů klonování a sekvencování identifikovaná sekvence nebyla homologní k žádné sekvencí se známou funkcí Identifikace mutovaného lokusu ■ Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis ■ popis fenotypu ■ identifikace T-DNA mutované oblasti ■ lokalizace T-DNA inzerce v genomu Arabidopsis NVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky Vyhledávání v knihovně IGF-BAC genomová knihovna obsahující 10,752 klonů s průměrnou velikostí inzertu 100 kb bakteriální klony uspořádané v mikrotitračních deskách knihovna nanesena na nylonové filtry pro hybridizaci s radioaktivně značenou sondou ©00© ©00© ©00© ©©©0 Mapovaní pomocí IGF-BAC databáze /. Sekvence přiléhající k levé hranici T-DNA ■ celkem 28 pozitivně hybridizujících klonů ■ 19 z nich lokalizováno na chromozomu 2 ■ 18 s podobností k mtDNA //. Sekvence přiléhající k pravé hranici T-DNA ■ celkem 6 pozitivně hybridizujích klonů ■ všechny lokalizovány na chromozomu 2 NVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky Lokalizace genomové T-DNA přiléhající k levé i pravé hranici T-DNA na chromozomu 2 Sekvence přiléhající k pravé a levé hranici T-DNA rga ftNSI mU21 PhjrB TÍH UDÍ! g>!M!» Tť fWH glďl77 • ^1 W i ä-" li! ä" |_