Fyzikální praktikum 4
Měření fluorescence a stopování vodního
toku
Úkoly
1. Zrealizujte měření koncentrace fluoresceinu ve vodném roztoku pomocí jeho fluorescence.
2. Proveďte a vyhodnoťte stopovací experiment průtoku vody neznámou hadičkou.
Luminiscence
Luminiscence je schopnost látky zářit intenzivněji než odpovídá rovnovážnému tepelnému záření.
Podle způsobu, jakým je luminiscence vyvolána, mluvíme o termoluminiscenci, chemiluminiscenci,
triboluminiscenci, elektroluminiscenci atd. Tento text se bude zabývat fotoluminiscencí, tedy luminiscenčním
zářením vzniklým po excitaci dopadajícím elektromagnetickým zářením, většinou
z UV oboru nebo viditelným světlem.
S
S
0
2
vr ic
S1
T2
T1
vr
isc
fosf.
fluor.
Obrázek 1: Jabloňského diagram. Molekula je absorpcí fotonu excitována ze základního singletového
stavu (S0) do např. druhého excitovaného singletu (S2). Rychlou vibrační relaxací (vr)
a vnitřní konverzí (ic) přechází do nejnižšího excitovaného singletu (S1) a emituje fluorescenční
záření (fluor.). Mezisystémovým přechodem (isc.) může molekula přejít do tripletových stavů (T)
a následně emitovat fosforescenční záření (fosf.) nebo dalším mezisystémovým přechodem přejít
do vibračně excitovaného základního singletu (nezakresleno). Nezářivé procesy jsou naznačeny
vlnovkou.
Návody pro fyz. praktikum (verze 16. září 2013) 2
Když molekula pohltí foton UV záření nebo viditelného světla, je podle výběrových pravidel
excitována do stavu se stejnou multiplicitou (tj. stejnou celkovou hodnotou spinu), jaký měla před
excitací (viz obr. 1). Protože většina základních elektronových stavů molekul jsou singlety (stavy
s nulovou celkovou hodnotou spinu), bude i stav molekuly po absorpci fotonu singlet. (Známou
výjimkou je například molekula O2, jejímž základním stavem je triplet.) Pravděpodobnost přechodu
excitovaného singletu do singletových stavů s nižší energií pomocí emise fotonu je veliká,
a proto excitované molekuly mohou okamžitě začít vyzařovat takzvané fluorescenční záření. Rychlými
relaxačními procesy se molekula často dostane do nejnižšího excitovaného singletu, který pak
velkou měrou přispívá k fluorescenčnímu záření. Je zjevné, že fluorescence mívá větší, případně
stejnou vlnovou délku jako excitující záření, jen vzácně má fluorescence vlnovou délku kratší.
Protože při emisi fluorescenčních fotonů dochází k povoleným přechodům, bývá doba života excitovaného
singletu velmi krátká a fluorescenční záření většinou pohasne řádově nanosekundy po
vypnutí excitujícího záření. Intenzita fluorescence může být relativně vysoká, pokud ovšem excitovaný
singlet není silně zhášen (deexcitován) konkurenčními nezářivými procesy (viz obr. 2),
např. při srážkách s okolními molekulami. Protože rychlost zhášení roste s rostoucí teplotou, je
fluorescence intenzivnější a doba života excitovaného singletu delší při nižších teplotách.
Excitovaný singlet ovšem může samovolně nebo pomocí srážky přejít do tripletového stavu, ve
kterém je spin jednoho elektronu v molekule otočen, kvantové číslo popisující velikost celkového
spinu S má velikost jedna a multiplicita stavu (2S + 1) je 3. Tímto způsobem může molekula přejít
i do různých vyšších tripletových stavů, ty ale většinou rychle přejdou nezářivými i zářivými
procesy do nejnižšího tripletu. Deexcitace nejnižšího tripletu emisí fotonu vyžaduje změnu multiplicity
molekuly, jde tedy o zakázaný přechod. Střední doba života tripletu je proto výrazně delší
než doba života excitovaných singletů, může trvat např. mikrosekundy. Záření tripletu se nazývá
fosforescence a bývá mnohem slabší než fluorescence. Stejně jako v případě fluorescence, doba
dohasínání a intenzita fosforescence rostou s klesající teplotou. Vlnová délka fosforescence bývá
v typických případech delší než vlnová délka fluorescence.
Po absorpci fotonu se ale molekula může dostat do vysoce reaktivního stavu a získaná energie
může přejít do různých chemických reakcí. Jedním z reakčních kanálů je fragmentace. Jestliže
došlo k ozáření pevné látky, budou vzniklé radikály uvázané na svém místě bez možnosti zreagovat
s jiným radikálem. Teprve tepelná aktivace umožní radikálům vychýlit se ze svých aktuálních poloh
a znovu vytvořit přetrženou vazbu. Produkt této reakce může být v excitovaném stavu a emitovat
foton, tento proces tedy také vede k luminiscenci. Intenzita takovéto luminiscence ovšem roste
s teplotou. Doba dohasínání závisí na aktivační energii reakce radikálů a za nízkých teplot může
dosahovat i několika dnů.
AB✳
AB + h
A + B
A + B+ −
AB + C
AB + C✳
+C
+C
+C
A + BC
BA
++
AB + e, A + B + e− −
ν
Obrázek 2: Mezi hlavní deexcitační procesy
patří emise fotonu (luminiscence), ionizace
(prostá nebo disociativní), různé typy fragmentace,
zhášení při srážkách, přenos excitace,
různé chemické reakce, přesmyky.
ttm t
C
Obrázek 3: Příklad průnikové křivky s naznačenou
dobou průtoku roztoku s maximální koncentrací
(tm) a střední dobou průniku barviva ( ¯t).
Návody pro fyz. praktikum (verze 16. září 2013) 3
Stopování neznámých toků
Stopováním vodního toku se označuje experiment, při kterém se voda potoka, řeky, nebo i jezera,
studny atd. označí vhodným stopovačem, např. barvivem nebo solí zvyšující vodivost, jehož koncentrace
se pak měří na jiném místě, např. za účelem prokázat spojení místa injektáže a místa
odběru vzorků. Stopovací experimenty lze použít např. ke zjištění, jestli znečištění vody v jednom
místě může vést ke kontaminaci okolních studní, dále ke kontrole potrubí, zda z něj neuniká část
vody pryč, nebo ke zjištění charakteru neznámého vodního toku, typicky ve speleologii. K základnímu
zjištění, kam sledovaná voda odtéká (např. spojení ponoru s vývěry) stačí kvalitativní měření
přítomnosti stopovače v místě detekce. Pro určení charakteru neznámého toku je ale potřeba
provést kvantitativní měření časové závislosti koncentrace stopovače (tzv. průniková křivka, viz
obr. 3) spolu s měřením průtoku vody jak v místě injektáže stopovače, tak v místě jeho detekce.
Jednou ze skutečností, které stopovací experiment může odhalit, je větvení neznámého toku.
Pokud tok obsahuje dvě větve, kterými voda teče různě dlouho, mohou se na průnikové křivce
objevit dva píky. Neznámý přítok nebo naopak odtok části vody jinam, než do místa detekce, lze
odhalit i bez stopovacího (většinou barvícího) experimentu prostým měřením průtoků. Když ale
zkoumaná oblast obsahuje přítok i odtok části vod, je potřeba sledovat nejenom průtoky vody, ale
i návratnost stopovače (tj. procento barviva, které dorazilo do místa detekce).
Průnikovou křivku lze ale využít i k odhadu rozměrů a charakteru neznámého toku. Nejúplnější
informaci nese celý průběh průnikové křivky, často se ale sledují i její zjednodušené charakteristiky,
jako jsou doba, za kterou dorazil roztok barviva s maximální koncentrací, nebo některé momenty
průnikové křivky, zejména nultý moment (M0) sloužící k výpočtu návratnosti barviva, první moment
(¯t) neboli střední doba průtoku barviva a druhý centrální moment (σ2) používaný k výpočtu
tzv. podélné disperze barviva:
M0 =
∞
0
C(t) Q(t) dt (1)
¯t =
∞
0
t C(t) Q(t) dt
∞
0
C(t) Q(t) dt
(2)
σ2
=
∞
0
(t − ¯t)2 C(t) Q(t) dt
∞
0
C(t) Q(t) dt
, (3)
kde t je čas uplynulý od injektáže barviva, C označuje koncentraci barviva a Q průtok vody v místě
detekce. Kromě těchto veličin lze sledovat např. poměr ¯t2/σ2, který charakterizuje, zda pohybu
vody dominuje advekce nebo difúze, a řadu dalších parametrů. V tomto praktiku si ve velmi
zjednodušené situaci můžete zjistit, jaké charakteristicky neznámého toku lze pomocí barvícího
experimentu stanovit a jaké způsoby jsou k tomu vhodné.
Detektory světla
Protože při řešení úlohy budete potřebovat detekovat luminiscenční záření, je vhodné stručně
shrnout principy běžných detektorů světla. Při detekci světla je možné využívat několika jevů:
• fotochemické reakce – např. klasická fotografie
• vnější fotoefekt – např. ve fotonásobičích a ICCD kamerách
• vnitřní fotoefekt – fotoodpory, fotodiody, fototranzistory. . .
Návody pro fyz. praktikum (verze 16. září 2013) 4
• zahřívání vzorku po absorpci světla – např. pyroelektrické detektory pulzního laserového
záření.
Následující text se bude týkat pouze fotodiod. Jak známo, na PN přechodu vzniká díky difúzi
volných nosičů náboje ochuzená vrstva s nevykompenzovaným prostorovým nábojem (viz obr. 4),
uvnitř které je relativně silné elektrické pole. Ochuzená vrstva má nízkou vodivost. Je-li v ochuzené
vrstvě absorbován foton s energií větší než je šířka zakázaného pásu, vznikne v ní pár elektronu
a díry, který zvýší vodivost ochuzené oblasti, což lze použít k detekci světla. Silné elektrické pole
v ochuzené oblasti odtáhne vznilý elektron a díru na opačné strany PN přechodu, což může vést
ke změně napětí na fotodiodě a také může být použito k detekci světla.
P N
+
+
+
−
−
−
ρ
E
P N++
+− I
ρ
E
++
++
+
− −
+−
ρ
E
p NP
P
nasgen.
−−
−−
−
Obrázek 4: Náčrtek struktury, hustoty prostorového náboje (ρ) a intenzity elektrického pole (E)
ve fotodiodě (vlevo), PIN fotodiodě (uprostřed) a lavinové fotodiodě (vpravo). U lavinové fotodiody
jsou znázorněny oblasti generace volných nábojů a jejich násobení v silném el. poli. Silně dopované
oblasti lavinové fotodiody jsou označeny tučnými písmeny, slabě dopovaná oblast je označena
malým písmenem p.
Fotony absorbované mimo ochuzenou oblast mohou také vytvořit elektron-děrový pár. Pokud
ale jeden z těchto nosičů náboje náhodně díky difúzi nedorazí na hranici ochuzené oblasti a není
jejím elektrickým polem přetažen přes PN přechod dříve, než dojde k jeho rekombinaci, pak
elektron-děrový pár generovaný mimo ochuzenou oblast nemůže přispět k fotonapětí nebo fotoproudu.
Citlivost fotodiody je tedy tím větší, čím větší je ochuzená oblast. Elekron-děrové páry
vzniklé přímo v ochuzené oblasti navíc reagují na silné elektrické pole okamžitě, zatímco odezva
diody na fotony absorbované mimo ochuzenou oblast je pomalá, protože je limitovaná pomalou
difúzí nosičů náboje k PN přechodu. Rychlost fotodiody může být limotovaná i kapacitou PN přechodu,
která klesá s rostoucí tloušťkou PN přechodu. Pro zvýšení citlivosti i rychlosti fotodiody
je tedy žádoucí zvětšit tloušťku ochuzené vrstvy.
Tohoto cíle je dosaženo v tzv. PIN fotodiodě, ve které je do PN přechodu vložena vrstva
intrinsického polovodiče s malou koncentrací volných nosičů náboje (viz obr. 4). To vede k rozšíření
ochuzené vrstvy a zvýšení citlivosti i rychlosti PIN fotodiody, takže některé PIN fotodiody jsou
schopné měřit děje s časovým rozlišením pod jednou nanosekundou.
Citlivost fotodiody lze dále zvýšit lavinovým zesílením signálu v tzv. lavinových fotodiodách.
Tyto diody mají v oblasti PN přechodu tak silné elektrické pole, že volné nosiče náboje tekoucí
PN přechodem vyvolávají lavinovou ionizaci polovodiče podobně jako elektrony vyvolávají ionizaci
plynu v doutnavém výboji. Tento proces vede ke zvýšení citlivosti fotodiody, ale také ke zvýšení
šumu a snížení rychlosti odezvy fotodiody. Aby lavinová fotodioda dosahovala co nejvyšší citlivosti
Návody pro fyz. praktikum (verze 16. září 2013) 5
a měla co nejmenší šum, bývá oblast generování elektron-děrových párů v široké slabě dopované
oblasti PN přechodu oddělena od úzké oblasti násobení, jak je znázorněno na obr. 4.
Průběh úlohy
1. Je vhodné začít sestavením aparatury pro detekci fluorescenčního záření fluoresceinu. Má-li
být měření citlivé, je potřeba nejenom soustředit co nejvíce fluorescence na detektor, ale
také co nejvíce potlačit vliv ostatních zdrojů světla.
2. Sestavenou aparaturu nakalibrujte, abyste mohli měřit koncentraci fluoresceinu.
3. Pomocí kalibrované detekční aparatury proveďte stopovací experiment vodního proudění
neznámou hadičkou. Hadičkou bude protékat voda s přibližně konstantním průtokem. Během
proudění vody Vám vyučující vodu na vstupu hadičky označkuje malým množstvím roztoku
fluoresceinu. Voda vytékající z druhého konce hadičky bude proudit skleněnou trubičkou,
kde můžete provádět fluorescenční měření.
4. Pomocí výsledků stopovacího experimentu vyvoďte závěry o rozměrech hadičky. Hadička má
kruhový průřez.
Pomůcky
• LED různých barev
• PIN diody
• Dva hranové optické filtry (nízkofrekvenční a vysokofrekvenční) s hranou na 500 nm
• Spojka (f = 2.54 cm)
• Klícková uchycení optických komponent
• Osciloskop, multimetr, elektronické součástky (odpory, vodiče, časovač CM 555 . . . )
• Roztok fluoresceinu se známou koncentrací
• Odměrný válec
• Plastové hadičky různých průřezů