Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
Ekotoxikologie
*Molekulární a buněčná toxikologie* *Toxicita látek ve vodních ekosystémech a ve vzduchu*
Luděk Bláha, Klára Hilscherová, Pavel Babica a kol.
RECETOX PřF MU Brno www.recetox.cz
Bakaláŕky a diplomky
Endokrinní disruptory
- „nové typy" znečištění - léčiva, vonné látky, UV filtry, pesticidy
- látky s vlivem na rozmnožování (reprodukční toxicita)
- látky s vlivem na časný vývoj organismů (embryotoxicita)
- látky ovlivňující kmenové buňky (karcinogenita)
Sinice a jejich toxiny
Směsi chemických látek
Kmenové buňky jako cíl toxických látek
Hlavní otázky:
- Hladiny a efekty - kde jsou?, v jakých koncentracích?
- Jakým mechanismem působí? v buňkách in vitro
- Účinky na vodní organismy? in vivo
- Jaké jsou možnosti odstraňování?
- Lze předpovídat (modelovat) účinky?
- Možnosti sledování (estrogenita, senzory, kity pro praxi)?
- Jak změnit legislativu
Zapojení studentů
- vždy řešení aktuálních vědeckých otázek ... spojených s reálnými problémy znečištění vody, vzduchu, potravin atd
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
Kidd, K.A. et al. 2007. Collapse of a fish population following exposure to a synthetic estrogen. Proceedings of the National Academy of Sciences 104(21) :8897-8901
5 ng/ L(!) 7 years
OH
Controls
Age 0 Age 1 - 4
+ Ethinylestradiol
Age 0
Age 1 - 4
50
50
50
ID
E Z
50 A
50
50
50 0
\ 1999 3 VWWVYb	490.3 ±68.1 . i^^fe^ 1
\ 2000	__j          19.1 ± 10.4 J,
---r--1° 2001	56.1 ±39.9 ,
j, 2002	9.6 ±2.2
, 2003	20.6 ±3.8 ,
- 2004                              51,9 ±21.2 ,	
	
600 300 4
50 0
300 50
0 300
50 0
£ 300
I 50
z 0
300
50 A 0
300
50 A 0
300
1999
180.0 ±48.0
2000
50.3 ±43.7
I 2001
117.7 + 20.0
2002 +EE2
2003 +EE2
2004
50 -\ 0
2005
0.7 ±0.2
2.6 ± 0.8
0.1 ± 0.05
0.1 ±0.01 J;
1      2      3      4      5      6      7 8 Fork length (cm)
1       2       3      4       5      6 7 Fork Length (cm)
Reálný problém endokrinní disrupce v ČR
Nádrž Pilňok
• Region Ostrava-Karviná
GERMANY ^Vj-!	POLAND	
Prague		
		
\      CZECH REPUBLIC	Brno ■	
AUSTRIA	Vienna* ■	SLOVAK REPUBLIC
(©)
Rak bahenní
Pontastacus leptodactylus
INTERSEX Samice s mužskými gonopody? Samec s vajíčky?
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
Integrované hodnocení
Sedimenty
• Pilňok
• Referenční lokality
Karviná, Steinlach (Německo)
Extrakce
\
Chemické analýzy
In vitro účinky
In vivo účinky
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
Bláha et al. (2006) Environment International Mazurová et al. (2008) Aquatic Toxicology Mazurová et al. (2010) Journal of Soils and Sediments
Chemical contamination ?
	Pilnok	Karviná	Steinlach	Dřevnice	Morava
16 PAHs	18420	10075	422	9427	5263
2 PCBs	18.7	6.7	0.86	14.8	13.6
2 DDTs	1.7	2.8	0.33	5.8	22.4
High concentrations of PAHs in PILNOK a her POPs (PCBs, OCPs) ~ low-average
(©)
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
	Pilnok	Karviná	Steinlach
Pb	47	109	3.5
Cu	29.1	31	2.9
Zn	45.7	86	21.5
Centrum pro výzkum toxických látek V^ť',/    v prostředí
Effects in vitro ?
Nástroje pro sledování endokrinní disrupce - aktivace jaderných receptoru -
Reportérové (GMO) testy s luciferázou
savčí buňky, kvasinky, umělé in vitro systémy
Série detekčních systémů pro:
Estrogenita Androgenita Dioxinová toxicita Retinoidní toxicita
Genotoxicita
MVLN bioassay
ng E2/well Sediment extracts (mg/well)
• PILNOK estrogenic
• Reference sediments - no effects
/^&~~S\ I Centrum pro výzkum (■i)    toxických látek V^tx,/    v prostředí
In vivo effects?
Asses ment of in vivo effects
Control        25%Pilnok     50% Pilnok     75% Pilnok    100% Pilnok
Potamopyrgus antipodarum Gammarus fossarum
2,5,8 weeks: mortality, 12 weeks: mortality,
ÚF^i I SÄ$rö^, hsp70 juveniles, histopathology
V^tx,/    v prostředí
1 mm
CO	50 -i
	
me	40 ■
O	
pe	30 ■
CO	
o	20 ■
«	
	10 ■
	
E	
	
	0 ■-
(©)
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
Pilňok zvyšuje počty a velikost F1 juvenilů
50%Pilňok
adults juveniles
100%Pilňok
Pilňok (sedimenty i extrakty) stimulují produkci embryí
		160
CD		140
		
Cti		120
E		
	o	100
t/)	H—' C	80
o	o	
	o	60
_Q		
E	o	40
LU		
■		20
O		
		0
75% Pilnok
* *
75% Pilnok
Centrum pro vý toxických látek v prostředí
1        2        3        4        5        6        7 8
week
--o- Pilnok-Sediment —•—Pilnok-Extrakt
Chemické látky vs. ED-toxicita ve vzduchu
PAHs C particle phase n gas phase
OCPs
1000 ° 100 g1 10
t 0." c 0.01 0.001
C particle phase E gas phase
Chemické analýzy:
+/- žádné trendy, žádné velké rozdíly mezi oblastmi,
PCBs
C particle phase gas phase
BIOTESTY
'si 000
O)
o
|- 100
co
£ 10 ít 1
CM O
- 0.1
antiandrogenicity
B particle phase ■ gas phase
REF 1
fTj		Irill	ll	ij		■ ii
2 3	4	5    6 1	2	3 4		
Které „nové" (neměřené) látky jsou odpovědné za pozorované účinky ?
B
100
10 n
O)
o
E 1
CO
E
E o.i
m
CM O
;= o.oi
antiestrogenicity
□ particle phase
□ gas phase
rn Ik
REF
1   | 2  |  3  | 4 |  5  | 6 A
dioxin-like toxicity
D particle phase ■ gas phase
REF
1 2
3 4 A
ň	Fi I	L ■	L	ii I	fi
	i.	X.	I.	r	
i	2	3	4	5	6
		B			
1  |  2 |  3 |  4 |  5 | 6 B
I v prostředí
Co to všechno znamená ? Závěry ?
• V prostředí jsou nebezpečné chemické látky, které chemické analýzy nedokážou postihnout, protože ...
- nesledují se ▼
- velmi nízké koncentrace - nelze je stanovit
• ALE: lze je měřit biologickými detekčními nástroji
->zavést biologické testování do monitoringu:
->praktický dopad na kvalitu života (člověka a organismů v přírodě)
Centrum pro výzkum toxických látek V^ť',/    v prostředí
SINICE (CYANOBAKTERIE)
masový rozvoj sinic = závažný problém:
>negativní vliv na chemismus vody (kyslík, pH,) ^produkce pachů, pachutí >produkce CYANOTOXINŮ - látky toxické či jinak biologicky aktivní ^
• komplikace při využívání nádrží (vodárenství, rekreace, chov ryb)
• nebezpečí pro ostatní živé organismy
. IMI   .11.   IVU I JlUI
C/anotoxiny ...
LPS
Saxitoxin
O
tí
OH
o.
Anatoxin-a
O3S1
h^Vh NY
nh
jh
0
Cylindrospermopsin
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
Microcystiny Nodularin ... peptidy
O HdC
TjIH CH3        NUH CH3
O     COOH O
H 1ST iMHr
Toxicita microcystinů
• Akutní letálnítoxicita ....
	Zdroj	Skupina	LD50 ug/kg při inj. i.p. myš
Botulin			0,00003
Tetan	Clostridium tetani	bakterie	0,0001
	Aphanizomenon flos-aquae		
anatoxin A	Anabaena flos-aquae	sinice	20
hadí jed-kobra		had	20
Microcystin LR	Microcystis aeruginosa	sinice	43
Nodularin		sinice	50
Kurare	Chondrodendron tomentosum	rostlina	500
Strychnin	Strychnos nux-vomica	rostlina	
/^fr~~S\ I Centrum pro výzkum
toxických látek V^ť',/    v prostředí
Ekotoxicita sinic
Reproduction (natality)
Fraction: non-MCs
Control
Spinach
Bloom biomass
0
Centru
toxických látek v prostředí
8      10     12     14     16     18     20 22
time (day)
•- BI O MI_
--- AQ.
k- C18 PERMEATE
C18 ELUATE - SPINACH
Extract
Vliv sinic na vývoj žab
Účinky nelze jednoduše spojit se známými toxiny
^Nové látky? -XJak vypadají? ->Jak působí
/^fr~~S\    Centrum pro výzkum [»^11    toxických látek V^ť',/    v prostředí
Jsou limity pro chemické látky opravdu bezpečné ?
Kontrolní 5 denní embryo zebřičky Danio rerio
Směs 14 chemických látek - všechny v bezpečných koncentracích
Centrum pro výzkum f W**^ )    toxických látek V^tx,/    v prostředí
Kmenové buňky (Dr. Babica)
Neoplastic \ transformation
Adult stem & progenitor liver eel Is
Differentiated hepatocytes
Transformed cells
Different gene expression Differences in: W 'Toxin uptake (0ATP)
•Toxin Metabolism (CYP450, GST) •Defense mechanisms & Excretion (Quenching capacity, MDR proteins)
Different sensitivity and response to cyanotoxins ???
Proliferation
Cyanotoxins
Sel ective cytotoxicity towards mo re d ifferentiated eel Is • Reg en erative pro I iferat ion o f I ess d ifferentiated
cancer or cancer-precursorcells •Induction of genotoxic events in surviving cells
Homeostasis disruption in the tissue •Tumor promoting & carcinogenic effect
/^fr~~S\ I Centrum pro výzkum
toxických látek V^tx,/    v prostředí
Kmenové buňky (Dr. Babica)
late
a po ptosis
necrosis
apoptotic ^^blebbing
# 4b
' early apoptosis
Figure 4: Upper panel: Detection of apoptosis and necrosis in WB-F344 cell culture upon nocodazole treatment (500 ng/mL, 16 h). Apoptotic cells were stained with Annexin-V-FLUOS (green fluorescence), whereas dead cells with compromised membrane integrity were stained with propidium iodide (red fluorescence). Lower panel: Effect of oncogene-activation (neu, myc, src) on the initial adhesion of WB cells evaluated by RTCAxCelligence SP.
Centrum pro výzkum toxických látek V^tx,/    v prostředí
Bakaláŕky a diplomky
Endokrinní disruptory
- „nové typy" znečištění - léčiva, vonné látky, UV filtry, pesticidy
- látky s vlivem na rozmnožování (reprodukční toxicita)
- látky s vlivem na časný vývoj organismů (embryotoxicita)
- látky ovlivňující kmenové buňky (karcinogenita)
Sinice a jejich toxiny Směsi chemických látek
Hlavní otázky:
- Hladiny a efekty - kde jsou?, v jakých koncentracích?
- Jakým mechanismem působí? v buňkách in vitro
- Účinky na vodní organismy? in vivo
- Jaké jsou možnosti odstraňování?
- Lze předpovídat (modelovat) účinky?
- Možnosti sledování (estrogenita, senzory, kity pro praxi)?
- Jak změnit legislativu
Zapojení studentů
- vždy řešení aktuálních vědeckých otázek ... spojených s reálnými problémy znečištění vody, vzduchu, potravin atd
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
Díky za pozornost, kdykoliv se ozvěte
bl ah a@ recetox. m u n i. cz