Fyziologie rostlin STANISLAV PROCHÁZKA IVANA MAC HÁČKOVÁ J A N K R E K u L E Jlftf Š E B Á N E K A KOLEKTIV 16 GENETICKÁ PODMÍNĚNOST FYZIOLOGICKÝCH PROCESŮ Boris Výskot Rostliny představují velmi různorodé skupiny organizmů, které mají řadu jedinečných fyziologických, vývojových a reprodukčních procesů ] kdy?, sc jedná z morfologického hlediska o organizmy pomčrně jednoduché, jejich molckulárnčgenetické procesy jsou podobné komplexní jako u živočichů- Řada obecných zákonitostí genetiky eukaryotických organizmů byla poprvé popsána pravé ti rostlin. Z mnoha příkladů lze jmenovat základní zákony klasické genetiky objevené L G. Mondelem u hrachu nebo objev mobilních genetických elementů popsaný B. McCIintockovou u kukuřice. Vzhledem k vysoké schopnosti regenerace a relativní snadnosti experimentální manipulace se rostliny staly v průběhu posledního desetiletí vyhledávaným modelovým objektem bunečných a molekulárních biologů. Genetická informace je u rostlin, podobně jako u jiných eukaryotických organizmů, lokalizována především v ehrumalinu bunečného jádra, Rostliny jsou však výjimečné mezi ostatními skupinami vyšších organizmů skutečností, že jejich genom jc tripartitní: genetická informace je přítomna nejen v jádře a v mi-tochondriích (jako u jiných eukaryotických organizmů), ale i v plastidech. Nositeli genetické informace jsou nukleové" kyseliny: informace spořívá v tripleto-vém uspořádání čtyř základních nukleotidů v molekulách DNA, které určují pořadí aminokyselin v bílkovinných řetězcích. Tento tzv. tripletový genetický kód jc tčmčř univerzální pro všechny známé organizmy a je tak výchozím předpokladem pro aplikace technik genového inženýrství. Sled základních reakcí genetického aparátu (replikace, transkripce a translace) lze dnes provádět též in vitro s použitím příslušných komponent z bakteriálních, rostlinných nebo živočišných buněk. Klíčový výľ.nam pro rozvoj genového inženýrství měly zejména objevy bakteriálních restrikčních endonukleáz (štěpících DNA podle její specifické nuklcotidové sekvence), DNA-polymeráz (které kata! y zují syntézu komplementárního druhého vlákna podle jednorctěz-cové matrice DNA) a iigáz (schopných spojovat řetězce DNA nebo jejich fragmenty) a virové reverzní transkriptázy (která může zpětné přepisovat jedno-vláknovou mRNA od 3'-konce a vytvořit komplementární vlákno cDNA). Mezi techniky, které nejvýrazněji ím způsobem rozšířily možnosti manipulací s rekombinantní DNA, patří především hybridizacc nukleových kyselin na membránách nebo na fixovaných chromozomech in situ, sekvenování (tj. stanovení pořadí nukleotidů v DNA nebo aminokyselin v polypeptidových řetízcích), imunologické metody stanovení specifických proteinu a ampiifikace sekvencí DNA pomocí polymerázové řetězové reakce {PCR, polymeráte chain reaciinri). 16.1 Struktura rostlinného genomu Většina jaderných genomů vyääích rostlin obsahuje 10* až I0UI párů bází (pb), což jsou hodnoty srovnatelné s jinými cukaryolickými organizmy (tab. ló.I). Nej vyšší zjiítcná hodnota činí n některých druhů až 10" pb (napr, u jmelí, Viseutn album), nejmenší genom má pravdepodobné huseníěek {Arabidopsis tha-liana), a to 7, I0T pb. Většina rostlinných genomů obsahuje vysoký podíl opakujících se (tzv. repelilivních) sekvencf DNA (viz odd. 16.2.2). U včtších rostlinných genomu (nad 2 pg DNA na haploidní jádro) bývá až 80% unikátních sekvencí DNA uspořádáno ve formČ krátkých délek (obvykle menších než 2000 pb) vme-zeřenýeh mezi krátké bloky repelitivních sekvencí podobné délky. Krátké jedinečné kódující sekvence jsou obklopeny repetitivními sekvencemi, čímž každému segmentu DNA poskytují unikátní identitu, což může ovlivňoval transkrípéní aktivitu příslušných genů. Čím je genom menší (pod 2 pg), tím menší je podíl 432 unikátních sekvencí íakto organizovaných; v těchto malých genomech bývají unikátní sekvence organizovány ve shlucích (Flavell 1980). Tab. 16.] Srúvťiártf velikosti genomú a priblif.nc' frakce repetitiv-nith sekvenci (v procentech z celkového obsahu jaderného ge-nomul u zástupců růíjiých fylogcnciiekych skupin organizmů -bakterii [E. CstQ, kvasinek (S. itrevlsiae}, rostlin nuhD5cmcn.njeti (borovice. Pintm sp,), dvoudiloíňých (husetifcek, A. ihaliami; tahák. V. fťifrífítíj)i; jmelí, V. album) a jednodt-ioinych (cibule, Ailium sp.. týle. O. sativa; pšenice, T. MSlivum), hmyzu (octomilka, D. mflanogaster) a savců. 0,965. 10* párii hází odpovídíí přibližní jednomu pikogrartui DNA. t>nih. resp. skupina organizmů Množství DNA na 11. ■. i -1 - il'i jádro (pb> Obsah repctilivnich sekvencí DNA (v 1) Mimujadtrrnj DNA (velikost v pb> pla/midy Escherichia OO'-IOY mI 4. 10* 0,1 bakterioťágy (IC-IO-1) pla/midy SSKcAarenjKtt mmwUm 1.6 . I07 ' mitochondrk- finta sp. 4.10"1 >90 Arabidopsif 7.10' 10 tJřnniatw mitochortdric labutím i,s. i90 jil.-Ktuly [14. M?) ÄMiím sp. 2.1010 >65 Otytá wi\« o.v 10» 65 Trilicum aextivtim >75 Druinphila meUuwgailer 1,2. 10" 2(1 mitochondrie 0.6. IQ1) savci 3.10* 60 Jaderný genom vyšších rostlin obsahuje asi 1O4 až 10* sirukturníeh genů, / toho v dospělé rostlině jejich exprimováno jen 5-10%. V různých rostlinných pletivech a buňkách bylo detekováno asi K transkrihované RNA-polyniera-/ou I a transferové geny (tRNA) transknbované s po- mocf RNA-polymerázy III patfí mezi evolučně vysoce konzervativnich geny, které nekódují žádné proteiny, nýbrž RNA tvořící součást genetického aparátu, Podle počtu kopií patří geny pni rRNA mezi vysoce repetitivnf (počet tandemových opakování genů pm rRNA je 1 200-32 000 kopií, tvoří asi 1 % celkové jaderné DNA), i když jejich značná frakce bývá inak-tivnť (Flavell 1986). Nicméně rRNA tvoří více než 90% z celkového množství RNA, neboť rostlinná buňka potřebuje ke své proteosyntéze asi 10 milionů cytoplazmatických rihoz-omů. Vzhledem k tomu, že potřebná kvantita molekul rRNA úzce souvisí s celkovou proteosyntetickou aktivitou buňky, podíl aktivních jícnů pro rRNA se v průběhu onlogcneze mění a variabilní může být dokonce i počet kopií genů pru rRNA (diferenciální amplifikace). 16.1,1.5 Geny kódující proteiny I když rostlinné organizmy jsou podstatně strukturně i funkčně jednnduííí neř živočichové, jejich genomy jsou podobné velké a komplexní a obdobné jsou i mechanizmy jejich funkční regulace. Také obecná struktura rostlinných genů je shodná s živočišnými geny a /.ahrnuje tri základní úseky: vlastní gen kódující Polypeptid a dva oblasti, které jej obklopují, na 5J-konci iniciační (vi/odd. 16.1.1.1) una3r-konci terminační. Temiinační sekvence na 3'-koncích kódujících sekvencí obsahují potyadenylaČní signály, které slouží k posttranskripční modifikaci související sc stabilitou inRNA. V aminoterminální oblasti některých trans-lačních produktů se nacházejí aminokyselinové sekvence, které nemají bezprostřední v/iah k funkci po-lypcpiidů a jsou z nich finální odstraněny, Tyio izv. tranzitní peptidy umožňují membránový transport proteinu do plastidň ticho mitochondrií. Nejlépe prostudovanými geny u rostlin jsou geny kódující zásobní proteiny v semenech, neboť jejich trarskripční a translační produkty lu jsou velmi Četné a navíc mají často rozhodující agronomický význam. Zásobní proteiny bývají klasifikovány na bázi jejich rozpustnosti v rQ/ných rozpouštědlech: u obilovin jsou hlavními zásobními proteiny prolaminy (rozpustné ve vodném roztoku alkoholu), které obsahují až 30 molámích procent prolinu a 40 molárních procent glu-taminu, mají však nízký obsah né který c h esenciálních aminokyselin (např. lyzinu). Určitá imunologická křížová reaktivita u prolaminů kukuřice (zein), ječmene (hordeinj a pšenice (gliadin) naznačuje značnou ho- mologii příslušných genů. Dalšími důležitými skupinami semenných proteinů jsou albuminy (rozpustné ve vode), globulíny (rozpustné v roztocích solí) a glu-teliny (rozpustné v roztocích kyselin nebo al kalií)- Zásobní semenné proteiny jsou kódovány genovými rodinami. Jednotlivé geny v počtu nčkoiika až několika desítek kopií na haploidní genom jsou lokalizovány ve shlucích nebo jednotlivě na různých chromozomech. Obvykle obsahuji.' introny a jejich produkty představují heierolognf skupiny proteinů různé velikosti. 16.1.1.6 Reverzně se replikující sekvence DNA Reverzní transkripce, tj. zpětný přepis genetické informace z RNA do DNA, je současí i rcphkačního cyklu savčích retrovirů a rostlinných kau limo virů; u eukaryoliekých organizmů jde o proces výjimečný. Některé sekvence DNA jaderného genomu se replikují reverzní transkripcí prostřednictvím RNA jako meziproduktu: patří sem koncové úseky chromozomů (telomery) a retroelementy. Telomery jsou specializovanými strukturami na koncích chromozomů, které netvoří nukleozomovou strukturu. Obsahují jednoduchou re petit i vn í sekvenci DNA hohatou na guaninová rezidua. Telomery se replikují pomocí enzymu telo-merázy, ribonuklcoproteinu, který syntetizuje vlákno telomerické DNA podle templátu uvnitř sekvence své RNA-sloíky (Blackburn I991). Druhou skupinou reverzne se replikujících sekvencí DNA jsou retroelementy, u kterých dochází ke transpoziei dceřiných kopií tvořených reverzní transkripcí intermediální RNA. Byly prokázány, podobne jako mobilní genetické elementy replikující se DNA-DNA-cestou, ve vysokém počtu kopií na genom u mnoha druhů vyšších rostlin (Grandbaslicn 1992). Jejich struktura je podobná retrovirům, retroelementy vsak nejsou infekční a nekódují plášťový protein. Je zřejmé, že retroelementy jsou fylogenetický velmi starými strukturami a mohou hrát roli v evoluční adaptaci rostlin. 16.1.2 Mitochondriální genom Mitochondriální genom je u vy&ších rostlin (ve srovnání s mitochondriálním genomem živočichů) extrémně velký a složitý (2.10* až 2,5. 10* pb). Skládá se obvykle z jednoho hlavního {master) chromozomu, 435 který obsahuje veškerou milochondriální genetickou informaĽi a četné repetitivní sekvence, Rekombinuu mezi těmito repetilivními sekvencemi vznikají subgo-iiomové cirkulární (popř. i lineární) chromozomy a plazmidy, v důsledku čehož je mitochondrial™ gc-nom variabilnější než plastidový. Mitochondriální gc-nom je spolu se špecifickými proteiny lokalizován v mítoehondriálním jádře a obvykle obsahuje více kopií chromozomů {Kuroiwa 1982). Milochondrie mají svůj vlastní replikační, transkripění a translační aparát. Jejich geny obsahují introny a po jejich vystřižení dochází ke spojování exonň rozptýlených v mitochon-driálním genomu {trans-splicing). M hoc hond riál ní geny řady druhů rostlin se často podrobují zvláštním posttranskripčním úpravám, které modifikují kódující schopnost mRNA. Mechanizmem, který jcStě není /cela objasněn (jde pravdepodobné o dea trn naci v polici C-6 pyrimídmnvého kruhu). dochází v mRNA ke tvorbé uracil u v místě, kde se původně nacházel cytozin. Tato modifikace mitochondriálních molekul RNA (RNA editing) vede ke zmenám leipletovčho kódu. a tím i k aminokyselinovým zámenám nebo výskytu iniciačních a termtnacních kodonů. Biologický význam procesu editovaní zjevné spočívá v regulaci množství transla-tovatelných mRNA bez de novo syntézy primárních transkriptú. 16.1.3 Plastidový genom Plastidový genom obsahuje obvykle několik desítek až stovek shodných cirkulačních dvouvláknových molekul DNA o velikostí 1,2. 10* ti 1,9.10s pb. Každá tato molekula DNA obsahuje rozsáhlou oblast přítomnou ve dvou kopiích v obrácené orientaci, která nesc operon kódující plastidové geny pro rRNA, Fyzikální mapování plastidového genomu prokázalo jeho vysokou konzervativnost mezi vzdálenými skupinami kry-tosemenných rostlin a řasami, u vyslích rostlin jc téz značná konzervativnost v pořadí genů. Na základč se-kvenování plastidového genomu bylo zjiStČno, že existuje vysoký stupeň homologie mezi plastidový mi a prokaryotickými geny. Tento výsledek potvrzuje hypotézu o cndosymhiotickém původu cukaryolie-kých buněk: plastidy (i mitochondrie) v/.nikly z volně žijících prokaryot, která vstoupila do předchůdců eu-karyolických buněk. Esprese plastidových genů je řízena na úrovni transkripce a translace a je závislá i na posttranskrípčních a posttranslačnícb modifikacích, mezi které patří i editování mRNA podobně jako u mitochoridrií. Plastidové geny obsahují nekódující introny, avšak jejich mRNA nemají ěepičkovou strukturu na 5-konci ani pnlyadcnylaíní signál na T'»konct (Weil 1987). Plastidy sice mají svůj vlastní genom i replikační, transkripění a translační aparát, avšak většina proteinů funkčních v plastidech je kódována jadernými geny, které jsou jako p re kurzorové molekuly translatovány na cyioplazmatických ribozomech a poté importovány do plaslidů. Tylo prekurzory jsou poněkud větší než odpovídající zralé proteiny, neboť obsahují v ami-noterminální části tranzitní peptid, který umožňuje jejich vslup do plaslidů. 16.1.4 Metody izolace genů a mapování genomu Nové metody molekulární genetiky umožňují aplikovat celou řadu strategií při izolaci a identifikaci rostlinných genů. Patří mezi ně předevSfm konstrukce knihoven cDNA z populací izolovaných mRNA (obr. 16.2). Jejich sublrakční hybridizace. kdy jsou srovnávány cDNA-klony připravené z. rů/.ných genotypů nebo orgánů, umožňují izolovat geny, které jsou známé pouze svým ťenotypovým projevem. Cenným nástrojem ke srovnávání příbuznosti genotypů i ke konstrukci vazebných map je polymorfic délky res-trikčních fragmentů DNA (RFLP, restriction frag* ment length polymorphism), detekovaná pomocí hybridizace na membránách se značenými sondami DNA. Polymeráz.má řetězová reakce (PCR) pak umožňuje izolovat a sekvenovat úseky DNA lokalizované mezi dvěma známými otigonukleotidovými sekvencemi. S pomocí oligonukleotidů s náhodnou sekvencí je také možné analyzovat genomovou potvmtirfli a pro vádél mapování genomu (například technikou RAPO, random amplified polymorphic DNA). Identifikaci genů odpovídajících za změněný fenotyp nebo studium specifické genové exprese v různých pletivech a orgánech umožňuje technika srovnáváni radioaktivně značených produktů polymerázovč řetězové reakce (tzv. differential display), tvořených z templářů cDNA připravených reverzní transkripcí /. populace izolovaných polyadenylovaných mRNA (RT-PCR, reverse Transcription PĽR). Při lokalizaci genu v genomu se obvykle vychází z genomových knihoven (obsahujících velké úseky 436 potyA-mftť/A AAAfAj 3' *t=.-i» reverzní Iranskriptázů + dNTP i'---------------------t 5' 5'-----------AAÍfJíJ 3T cDHkmRNA-tybrid alkalická hydrolýza mRNA. C: S 3 '-vfésanknvitým kanCBfít DNA-polymn/áza ■+ dNTP restriKcni ond-L-r-Lk CÁ.-Ti C: -----------------t Sl-nukleáza \- h..i dna 5" V1 L:iJ.'i.'i -tiIri f ;:i:.'.'lt:t;l t&rrTiirtílni trensferir^ + dGTP 5T 3'GGGCG* 5' tefrfiinálni transteréja + dGTP 3' ccccc- A ccccc 31 t 5' reasůciato (llgace) fl/íř* Obr. 16.2 Jedna i. možných meiod rhřífiravy knihoven ťDNA komplementárních k ixjpul.it;i mRN'A. Pnriím krokem jc izolace celkoví HN'A / rnsllinrijího jjiftleriílu, nesleduje SíHíkce polyadtnylovallýLl! molekul mRNA jl -synlí/a komplcmctlláíníllCi fclívcc Í5MA pomocí reverztiflM.nskripr.a2y inicLůVařul t. i]]igii — /J-iaktamáza -> ytc-etement (Zea mays): TAGGGATGAAA-ATCCCTACTTT- transpozáza promotor gen 2 -> -TTTCATCCCTG -AAAGTAGGGAC Ds-element {Zea mays): TAGGGATGAAA-ATCCCTACTTT- mutovaný transpozázový gen promotor gen 2 -TTTCATCCCTG -AAAGTAGGGAC Oba. 16.3 Srovnám struktury mobilních, gencliekých cleincniú. u haktení a rostlin. Tni je jedním t. ncjlčpe prostudovuných imns|is jsou zástupci rostlinných mobilních elementů izolovaných z kukuřice (Zrcr jjwy.Tj, Ax je Uv. autonomním elementem, neboť ncy; gen pro transporiizu umožňující jeho mobilitu v rosilinncm jaderném genomu. Dclccí, popf. jmou mutací v uanspozázovrirn genu vznikají ncau-tonomnt elementy lypu />.v, jejichž mobilita múze byl zprostředkována enzymem transpozázou, produkovanou v táže buňce autonomním elementem Ac. NiHným předpokladem mohihzacc vsech bakteriálních i rostlinných elementů je přítomnost (nc vidy zcela shodných j ohrácenvth opakováni nukleotidových sekvencí na jejich koncích íu Tni jc ivoreno 38 nukleotidy, u uvedených rosilinných elemeniú obvykle JI nukleotidy), bělky mobilních elementů Ttti a Ať jsou podobné íasi 5CXXJ pb), elementy ÍH mohou být podstatne kratäí. Nčkterč gcnomové změny vznikají následkem vnějších stresových vlivůř jiné jsou součásti normálního ontogenetického programu nebo k nim muže docházel i náhodné. Replikace DNA začíná v eukaryo-tickýeh buňkách na velmi mnoha počátcích (asi několika desítkách tisíc), tento poČĽl je u odlišných druhů rostlin i pletiv a orgánů různý. Jsou sd ražen y v rodinách a každá rodina přitom obsahuje místa, která jsou aktivována ve stejnou dobu. Konstitutivní heterochromatin se replikuje v pozdní fázi S bunečného cyklu a nepodrobuje se procesu crossing-over pfi mció/c WjilhiH a Cul lis (I9HÍ) vyslovili teorii, že genomová flexibilita rostlin je odrazem jejich mimořádné adaptivní schopnosti na měnící se životní prostredí. Příkladem léto flexibility jsou polyploidie, přestavby chromozomů, změny v chromozomálním imprintingu, genové amplifikace a redukce i aktivita transponovatelných elementů. Mechanizmy způsobu-jťcí změny genomu mohou být různé, některé mají programový charakter (např, amplifikace genů s cílem zvýšení kvantity jejich produktu), jiné jsou náhodné (obvykle transpozice mobilních elementů). Snad nejvéiším rozdílem mezi rostlinami a živočichy je neschopnost lokomočního pohybu, u rostlin. Zvířata se mohou přizpůsobovat měnícímu se životnímu prostředí svým chováním, zatímco rostliny lak mohou činit pouze krátkodobými fyziologickými regulacemi nebo dlouhodobí /miniími svého vývoji;. U živočichů je zárodečná linie založena v časném stadiu vývoje, zatímco u rostlin je reproduktivní vývoj zahájen iú. premenou vegetativního prýtového vrcholu v kvetní v reakci na prostředí nebo stárnutí. Tento způsob reprodukce znamená, že u rostlin v podstatě není přítomna zárodečná linie sírictu sťiiso a že gamety jsou tvořeny z mnoha odlišných bunečných linií přítomných v různých květech rostliny. Rostliny jsou podstatní více ml c ran tni vůči chromozomá-lním abnormalitám než živočichové. Příkladem flexibility rostlinného genomu je i obrovská rozdílnost ve velikosti genomu u různých druhů krytosemenných rostli r. Krytosemenné rostliny jsou staré pouze asi 150 milionů let, avšak mají pritom velmi široké rozpětí množství DNA nu jádro, od 0,1 pg až do 100 pg u různých druhů (Bennel a Smith 1976). Savci jsou fylogenetický starí ŕ skupinou organizmů (asi 300 milionů let), ale množství DNA v jádře je u většiny druhů téměř shodné. Rostliny jsou tak výrazným příkladem t z v. paradoxu hodnoty C tedy ztráty korelace mezi množstvím DNA v jádře a komplexitou pří- slušného organizmu, Amplifikace genů indukovaná stresem je považován;* za jeden z nej významnějších faktorů evoluce genomu a tedy i vytváření nových znaků. Názorným příkladem íl e x! bili ty rostlinného genomu jsou rychle, vnějším stresem indukované genetické i epigenelické změny morfologických a fyziologických znaků u Inu, které jsou děděny v řadě pohlavních generací (tzv, genotrofy), 16.3 Řízení procesů diferenciace Procesy pletivové a orgánové diferenciace jsou řízeny kombinatorickou aktivací promotorových sekvencí mnoha genů, která je přísnč regulována časově a místné (Lyndon a Franc i s I992J, Klíčovou roli při (Slíi']vik-::lu mcnsLi-iTL-ik-kých buněk \ orgánové sys té my hraji zejména honu-otiekii gcitv, k [crč kódují transkripční faktory aktivující specifické geny. Proteinové transkripční faktory jako produkty regulačních genii mají d v ú vý/.rtaitiné ohlásit: konzurvativní DNA-vazehnou doménu, která zajišťuje specifuu vazby na regulární sekvenci DNA, a aktivační doménu, která je schopna interagovat s jinými faktory. Dosud známé mutace v homeotických genech mají za nasiali1 k /měnu identity vegetativních nebo květních orgánů. Tvorba květních ítrjjiinu reprezentuje časově poslnupný proces; homeotické geny jsou aktivovány (pravděpodobně prostřednictvím rostlinných hor-mnnů Či jiných efektorů) pouze v určitých pletivech a v určitém období vývoje rostliny a jejich prodá k ty, transkripční faktory, řídí procesy diferenciace aktivací jiných, morfogenelických genů. 16,3,1 Homeotické květní geny Na základě íenotypového projevu jejich mutací jsou homeotické kvílní geny klasifikovány do tří skupin (Schwarz-Sommcr et al. 1990): První .skupina zahrnuje mulace ovlivňující vývoj nebo iniciaci květního primordia. Takové mutantní rostliny netvoří vlastní reprodukční orgány, ba ani k ví mí obaly. Patří sem typy, u kterých mu tamní genové1 produkty interferují s hormonální řízenou tvorbou kvčtního primordia (mutanty steriíis ísteriioides) nebo narušují vývoj primordia po květní indukci (mutace squamata a xquamosa). 440 I) ľ n h n 11 skupinu homcolických mu ta.nl ú ivuŕí mu-lacc, které způsobují zmenu kvetní symetrie. Tak napríklad u hledíku, který má květy soumčrné pudle jediné osy (zygomorfní), způsobuje mutace c.yc.ioidea tvorbu kvétů a k vrt n ich orgánů paprscitĚ souměrných ■ .jkt im 11:101 ťn ich J. Třetí skupina homcolických genů determinuje identitu jednotlivých květních OTgánů a jejich architekturu. Kvčty mají typické uspořádání svých orgánu ve čtyřech kruzích: v prvním a druhém vnějším kruhu se vytvářejí kvílní obaly, ij. kališní lístky (sepaly), resp. korunní plátky (petaly). ve třetím a Čtvrtém vlastní pohlavní orgány, tj. tyčinky, resp. pestťky (kar-pely). Všechny dosud známé homeolické mutanty této třetí skupiny se vyznačují tím, že jediná mutace ho-meotického genu zasahuje vždy dva sousední květní kruhy a že existuje ráda nezávislých lokusů, jejichž mutace se projevují shodným homeotickým fetioty-pem (obr. 16.4). Tak například byly identifikovány geny, které způsobují výskyt pestíkovitých sepal a ly-činkovttýeh peta! (geny mitiaiti, mneha, apetaia2). c Obr. 16.4 Kvilní diagramy (příčné řezy) husenícku iAtabidopsii limitám) - ntmtiilnť rostlinu * dv« homcoliukč mulanty. (a) Nor-milní lyp inrioupohlivný kvtlK [t>) mutant inslUista, u nítioč do-.In.-: k muniční korunních plácků v kalií ni lísiky a Lvíinek v pes-líky (kvil je Iníy jcdnopítfitovný, samicí), (c) mutant «ujvhphb, jchoí tyfiinky jsou iransformovany v dsAM kruh korunních pLalkú ji peslíky v kahšní iísiky (kvil ber. rcpnxlukCníuh orgíná). pctaloidníeh tyčinek a sepal oi dníc h pestíků (geny plena, petuiaidea, agamous) nebo sepaloidních petal a pestíkovitých tyčinek (geny deficizns, ghbosa, pis~ iiliarri aj,). Analýza k Ion ováných rostlinných homeotických genů deftcie.ns a tijtnmnus 11 jimi kódovaných proteinu odhalila oblast s vysokým stupněm homologic k DNA-vazebný m doménám dvou známých tran-skripčních íáktorů u fylogenetický velmi vzdálených organizmů, savců {SRF, Strum reapansefactor) a kvasinek (MCMf, mmichromosome mďinteitattce gene). Tato konzervativní oblast je proto nazývána MADS-doménou [MCMi, Agamoux, Deficiens, Stý) a byla později nalezena i u řady jiných rostlinných homeotických genů. Tato srovnání naznačují, že molekulární mechanizmy řízení ontogeneie u rostlin a jiných eu-karyot mohou být obdobné. 16.3.2 Duální systém dědičnosti u eukaryotických organizmů U eukaryotických organizmů existují dva systľitiy dedičnosti, i riichí jeden odpovídá z.a přenos genetické informace mezi pohlavními generacemi a druhý za přenos informace o expresi genů v průběhu ontoge-neze (Maynard Smith I9TO). První systém je založen výlučně na genetické informaci dané sekvencemi nukleotidů v Ľ>N A a řídí se principy mendelovské de> d i čnosti. Druhý systém, nazývaný cpígcnctická dř-rliriniM vychází íéž zc základní genetické informace uložené v sekvencích DNA. je v Sak odpovčdný za přenos informace o aktivitě genii v buněčných liniích. Je regulován různými vnitřními a vnějšími faktory a je obvykle doprovázen specifickou modifikací příslušných oblastí chromát i nu. Tyto modifikace mohou byt v určitých případech, zákonitých nebo stochastických, přenášeny i do pohlavního potomstva. Dědičnost epi-gc n etických změn neodpovídá mendelovským zákonům klasické genetiky. Například pnramotuce(tj. dědičné změny v expresi genů způsobené interakcí a lei), popsané zejména u kukuřice, odporují mendelovské m u principu o nez.ávislé segregaci ale I. Mendelovy pokusy s hrachem vyústily ve vyslovení principu identity reciprokých křížení. Toto pravidlo neplatí u některých mczidruhových křížení í p arén lál u Ľ dominance) a taktéž u genů, které jsou odlišné exprimo-vány v závislosti na pohlaví rodiče, od kterého byla příslušná ale la zděděna {pare má In ŕ neboli genorpový 44 I Tub. Ifi.2 Srovnání a pfíVtady rviklcrých cpigenctických procesů u krytosemenných rusilin a savců. KrytcMctncnní rostliny Savci Hpigenetické procesy parenlální imprinting pouze v e:ri raejiihryi máln íc h nleiivcch - Inploidnf endosperm Q matemálnl -i- 1 pMcmálni génom) fada genů v embryonálních lkaních, karcinomy di/omickčho původu, projev mnoha nervových, chorob v závislosti na rodiíovském původu kontrola výživy embrya ťitracmhrytinální patcmllni Lnaktivacc X-chromozomu mn/iinM aiulrngrnivc. paneiwgeneze a poJyploidic vysoká ípfimzenŕ i experimentální) nemají afclick(í interakce paramutacc, trarcgcny Iransvekce kumpenzacc dávky genů nesených pohlavními : lil Mimmimj lyonizacc X-chromozomu u některých d voudnmých rostlin'1 lyomzace jednoho SAinicmo X-chromozomu 11 ...k ■ 1 \ .11 1 l.illv'i TH.I velmi iaslý jev častý jev lunkOni 1 popŕ. genetická) haploidie l lin:-|.-l ■. 1 . k.l I...'.' vývinu, ;■■ úl.i. 1 thrnmoz.nniy u niklerých dvoudomých rostlin pohlavní chromozomy, lidická enktuze v buňkách produkujících imunoglobuliny, tvorba hapioulnuh gamet f-.iiinl Mm : 1- -n 111- ;i.ri u meíidruhnvýeh hybridů berný jev častý jev specifická zírala (snd> chromozomu. me/idruhovr hybridy u ječmene hybridní buňky v kulturách rn ritro Mechanizmy mccylacc DNA mctylacc promete v nukleolttlový CC, CNC i nesymetrických >rů i no k m m'cii penú CG (vzácnřji i CNC1) íasná/po/dni doba replikace DNA iasni replikace aktivních a po/dni i..-j111 k.: l - :.' Iľukliv nich- UiJIli.ilr'.H J1 l h ..liiii1:'!! aoctyLacr nuk leuzomových histimii deocetylace nelrjn c tvorí pf fakultatívni heicTOchíoírKUin v endospenmu skribovaných misi ní i rm pt. inakiivní X-chromozom vtisk, imprinting). (iennmoví imprinting je tedy definován jako proces, kdy specifická mudifikace chro-mulinu game* rodičů v závislosti na jejich pohlaví vede k funkčním rozdílům mezi samčím a samicím genomem v diplcidních buňkách potomstva. Zatímco u živočichů (zejména u savců) je genomový imprin-ting zákonitým jevem, u krylosemenných rostlin byl dosud prokázán pou/c v mimoembryonálních pletivech semene, endospermu (tab. 16.2). Tento rozdíl X r- 10/Jm Obr. 16 5 Melafíze i2n = 24, XY) v kořenovém merisiému samci rostliny dvoudenního druhu knoLovky bíle iMcInncinum dbán) U krVOlovky je s-amcí pohlaví hctcrogamchckč íi|. v pi aíriicích jsou tvořeny gamety s Y-chromozomem nebo s X-chromozomcin), za-ifmcr. samicí rostliny jsou Iwmogamciickc {2a = 24, XX). můře být způsoben zejména skutečností, ze velkií většina druhú kryloscmenných rostlin jsou hc-nnufroditL-: vytvářejí oba typy gamet, samci i samicí, na stejných jedincích. Pouze asi 5 % druhů krytosemennýeh rostlin jsou druhy dvoudomč, které tvoří odděleně jedince samčího a samičHio pohlaví (Grunt et al, 1994). NČ-které dvoudomé druhy mají í heteromorfní pohlavní chromozomy (např. knolovka bílá, Meiandrium album, obr. 16,5). 16.3.3 Genomový imprinting u rostlin U krytosemennýťh rostlin dochází po vniknutí pylové láčky do sam i Čího zárodečného vaku k procesu tzv. dvojího oplození. Jedna ze dvou samčích gamet oplodní vaječnou buňku, zatímco druhá samčí gameta splývá s centrálním jádrem zárodečného vaku, který u většiny druhů rostlin vzniká fúzí dvou haploidních jader ve středu zárodečného vaku. Na procesu di-ploidrií emhryogeneze se vsak podílí jen oplozená bunka vaječná; oplozené dvoujaderné centrální jádro tvoří iriploidru extraembryonúlní pletivo (endo-sperm), které vyzivuje embryo během jeho vývoje. Genom embrya je ledy tvořen jednou materskou ajed-nou otcovskou sadou chromozomů, zatímco v endo-spermu jsou kombinovány dva mateřské a pouze jediný otcovský genom. Rozsáhlé studie na kukuřici prokázaly, ze jestliže je tento poměr genomu v endo-spermu odlišný, embryo abortuje (Kermicle a Alle-man 1990), Tyto analýzy též dokládají, že nepřítomnost Otcovských zástupců osmi t. 19 /.koumaných chromozómových ramen způsobuje podstatnou redukci velikosti semene. Tento specifický rodičovský efekt je omezen pouze na endosperm; ve vlastní embryonální linii dosud u rostlin nebyl prokázán. Odděleni: oplození ledy zakládá zárodečnou dráhu embrya relativné prostou imprintovaných genů, zatímco geno-mový imprinting jc významný pro vyživovací funkci mimoembryonální bunečné linie, vzniklé druhým oplozením. 16.3.4 Mechanizmy epigenetických procesů Ačkoli mechanizmy nejsou dosud zcela vysvětleny, je zřejmé, že v epigenetických procesech, které odpovídají za funkční plasticitu genomu, hrají rozhodující úlohu metylace DNA, kiwlika replikace DNA a struktura chromatínu. Je dokázáno, žc mctylacc DNA (zejména cytozinu, obr. 16.6) negativné ovlivňuje expresi genů u většiny eukaryotických organizmů (Jost a Saluz 1993). Zatímco v jaderných ge-nomech savčích druhů je metylováno asi jen 8 % N _C c ti + S-adenoz^-L-melionin i C DNA-m«tyitran«i»ráiá #í!rc\ H cytozin 5-metylcytozin Óhr lft.Ci Mrtdiťilc:u:e cyto/inij mdylací v pol-ruircm metyldvť! skupiny jc S-adenn/yl-l.-mclio-nin. cytozinových bází, u rostlin dosahuje tato hodnota až 30 %. Vysoký stupeň metylace rostlinných genomů |c /půsolien především zrněným, nh^ahetn hypmiiety iovaných repetit i vních sekvencí (až 90 % genomu). Navíc jc rostlinná DNA metylována v sekvencích CG, CNG (kde N je jakákoli báze) i v nesymetrických sekvencích DNA, zatímco v genomech obratlovců se metylace cytozinu vyskytuje téměř výhradně v duble-tech CG. Genomy obsahují výrazně hypermetylované i hy-pometylované oblasti: hypermetylované domény za-hrnu j i repelilivní sekvence DNA (heterochromatin), které se nepodrobují procesu crossing-over při meiů-ze, zatímco hypomelylované domény (tzv. hypomcly-lované ostrůvky) jsou rekombinačně aktivní a představují především konstitutivně exprimované geny. V některých výjimečných případech, jako je inakti-vace (lyonizace) jednoho ze dvou pohlavních X-ehro-mozomů v samicích buňkách savců (kompenzace dávky genů nesených tímto chromozomem), dochází k hypermctylaci celého chromozomu (Grant a Chap-man 1988. Výskot et a], 1993). Metylace cytozinu se pří mitoliekčm dělení huňky dčdí pomoci udržovacích DNA-metyltransferáz. Znamená to, že tyto metylázy rozpoznávají hcmimelylovanou DNA, vznikající se-mikonzervativní replikací, a metylují nová, dceřiná vlákna DNA. Tento mechanizmus tak poskytuje molekulární základ pro buněčnou dčdičnost specifických genových aktivit v průběhu individuálního vývoje. Změna metylace může vést k dědičným abnormalitám v expresi genů, které nazýváme epimutacenů (Holli-day 1990), Nejčastěji užívaným činidlem k e\[n:ri-mcntální indukci zmčn metylaěního stavu DNA je 5-az.acytidin, který může být do DNA včleňován na místo cytozinu nebo metylcytozinu a blokuje mety-laci DNA kovalentní vazbou do aktivního centra DNA-metyltransferáz. Metylace promotorových úseků genů jsou často spojeny s jejich inaktivací a jsou orgánovč specifické, Bylo též prokázáno, že metylace DNA jsou zodpovědné za aktivaci ainaktivaei rostlinných mobilních genetických elementů a vnesených cizorodých genů (viz odd. 16.4.4). Metylace může inhiboval genovou expresi tím, že brání vazbě specifických proteinových transkripčních faktorů, například vazbou mclylcytozin-spccitických proteinů. Ačkoli role metylace cytozinu v inaktivaci genů je evidentní, je pravděpodobné, že metylace DNA není příčinným, ale spise sekundárním procesem, který zajišťuje přenos informace o aktivita genů (epigene- 443 lieké informace) v průbčhu buněčných delení (Lnek et al. 1987), U msti i ti dochází k přeměně apikálního meristému / vegetativního stavu na generativní (indukce kvetení) v závislosti na faktorech vnějšího prostředí, zejména na svetle a teploté. Některé rostliny vyžadují k indukci kvetení chladoví působení, tzvr jarovizaci, Ja-rovfzMe je typickým epigenctiekým procesem, který je omezen na jedinou pohlavní generaci; nepřenáší sc do pohlavního potomstva. Burn et al, (1993) prokázali, re chladové působení navozuje rozsáhlé snížení hladiny metylcytozinu v rostlinném genomu a současné demonstroval i, že předčasné kvetení lze navodil i pomocí hypometylaíní látky, 5-azacytidinu. Homco tieké geny, které řídí tvorbu květních orgánů (v 17. odd, 16.3.1), jsou zvláště citlivé na regulaci exprese prostřednictvím metyl Líce cyto/.inu. H\pcrimentální hy-pometylace rostlinného genomu (navozená aplikací 5-azacytidinu nebo prostřednictvím protismyslného genu k DNA-metyltransferáze) vede především ke zménám identity květních kruhů a kc snížen( samčí 1 samicí fertility (Výskot et al. 1995, Finnegan et al. 1996). Klíčová úloha metylace DNA v procesu determinace pohlaví byla prokázána u dvoudomé rostliny knotovky bílé, kde aplikace 5-azacytídinu vedla u samčích rostlin k pohlavnímu zvratu: byly zde aktivovány geny odpovědné za tvorbu pestťků, a lak navozen vznik oboupohlavných květů. V tomto případe Slo o epigenetiekou změnu jednosměrně dědičnou: byla přenášena do pohlavního potomstva pouze tehdy, kdy oboupohlavná rostlina byla v křížení použita jako pylový donor (JanouSek et al. 1996). Během dlouhodobé kultivace rostlinných pletiv in vilro, které ke svému růstu vyžadují aplikaci exogen-ních auxinů acytokininň, občas dochází ke spontánní Ztrátě potřeby uvedených rostlinných hormonů. Tento klasický epigenelický jev se nazývá hab i tunu a je způsoben aktivací rostlinných genů účastnících se bio-syntézy hormonři (Moins 1994). Habiluace na rostlinné hormony fauxiriy nebo cytokininy), i když je potenciálni reverz ibilní, je ve vysokě Inek venci mitolicky udržována v kultivovaných buněčných liniích. Habilitované buňky svou schopností autonomní proI iterace připomínají rostlinné buňky nádorové, kieré mohou být iniciovány růdnými patogenními organizmy (napr. bakteriemi, hmyzem nebo houbami) nebo se objevují u některých hybridů „spontánní" jako důsledek určitě kombinace alel (tzv. genetické nádory). 444 16.4 Genové inženýrství rostlin a jeho uplatnění v základním výzkumu a šlechtění V průběhu posledních dvou desetiletí byl repertoár metod genetiky a šlechtění rostlin rozšířen o techniky genetických manipulací. Jako genetické manipulace s rostlinnou buňkou označujeme všechny nekonvenční techniky prováděné in vitrn. kterými lze modifikoval rostlinný gcrtOm. Genetickí- manipulace u rosí -lin lze z hlediska používaných metod rozdělit do dvou hlavních směrů: - buněčné inženýrství, zahmající modifikaci genetické informace recipientního organizmu prostřednictvím přenosu celých buněk (parasexuální hybridizace) nebo izolovaných organcl, - vlastní genové inženýrství, reprezentující vnášení klonovLíných genů (genetická transformace, trans-genoze). KuiiMi-LKcr tr.jnslorstiovaných 1 h;m\iym)iLh.i bu nčk a rostlin nemá význam pouze vc šlechtění, ale je cenným nástrojem v základním výzkumu pfi studiu struktury a stability genomu, regulace genové exprese, izolaci genu i při analýze molekulárních mechanizmů vývoje a metabolizmu rostlin. Obr. Iť.7 Nldor cruH-n-galt vyvolaný průsífedriiavíin onluigen-afívi kmene Agritbaclerřuni liifHcfitL-iens tiú fhjJ'jiHlhŕ rasů ini taháku INicatíůim tabnctim) pastované v kultuře in vilro. Nadprodukce jbuninu a ťvii)kimnu ivofcnťhn v nfetorovýt t> buňkách vede i k indiikťi růstu kisÍL-nú a prýlových výhonků v okolí nádoru. 16.4.1 Metody vnášení klonovaných genů do rostlin Vnášení genů, obvykle klonovaných v bakteriálních plazmidech, do rostlin je většinou zprostředkováno pomocí přenasečů, tzv. vektorů (zejména bakterií nebo virů). Vhodné vektory by mely mít snadný vstup do rostlinné buňky, široký okruh hostitelských rostlinných druhů, schopnost včlenění do rostlinných chromozomů (zaručující stabilitu při mitóze), schopnost přenosu do semenného potomstva a neměly by negativně ovlivňoval fcnolyp rostliny. Ne všechny vektory tyto parametry splňují. Cizorodá DNA je po vstupu do rostlinné buňky obvykle integrována do rostlin-ných chromozomů v náhodných pozicích. Cílenou integraci klonované sekvence DNA (podrobené například definované bodové mutagenezi) do určitého lo-kusu rostlinného genomu lze realizovat vhodnou konstrukcí vektorové molekuly DNA, obsahující alespoň částečně shodnou sekvenci k cílové genomové DNA, a dosáhnout tak homologní rekombinace. Cílená integrace genů je hčí.nc prováděna u kvasinek i živočichů, u rostlin však dosud bylo dosaženo jen sporadických úspčehů. Tato technika by umožňovala nejen studium genové funkce a regulace, ale i cílené šlechtění rostlin eliminací nežádoucích genů (gene replacement). Nej rozšířen čjSírn vektorem k přenosu DNA do rostlin jsou agrobakteriální plazmidy. 16.4.1.1 Agrobakteriální vektory Rostliny se staly středem zájmu molekulárních genetiků teprve v 70. letech v souvislosti s objevem plaz-midů 71 (tumor inducing) půdní patogenní bakterie Agrahacterium tumefaciens, která je schopna infikovat většinu druhů dvoudčloí.ných a nahosemenných rostlin. Tato bakterie funguje jako „přirozený genový inženýr1", neboť po infekci rostlinné buňky stabilně včleňuje část svého onkogenního plazmídu do rostlinných chromozomů. Tohoto procesu lze využít k přenosu žádaných genů po jejich předchozí integraci do transponované sekvence DNA. Agrobacterium lumefaciem je půdní gramnegativní bakterie z čeledi Rhizobiaceae, která vyvolává tvorbu nádorů typu crown-gatt na poraněných místech rostlin (obr. 16.7). Její infekčnost je podmíněna přítomností velkého plazmídu 77. na kterém se nachází mj. i oblast T-DNA {irwuferredDNA) a geny odpovědné za virulenci. Vlastní morfologii a fyziologii rostlinných ná- dorů ovlivňují geny ze segmentu T-DNA s promotory eukaryotického typu, které jsou v nádorových buňkách konstitutivně exprimovány. Jde o geny, jejichž produkty katalyzují syntézu auxinu (tryptofan-2-mo-nooxygená/a, imsM. a indol yl-3-acetam id hydro láza, utaH) a cylokininu (izopentenyltransferáza, řpf) a kondenzaci organických kyselin s bazickými aminokyselinami za vzniku látek opinového typu (například oktopinsyntázy nebo nopalinsyntázy). Mimo T-DNA nese 77-plazmid i geny zodpovedné za virulenci, ka-tabolizmus opinů bakteriální buňkou a konjugativni" přenos 7i-p!a/midu mezi agrobaktcriálními buňkami (obr. 16.8). Přenos genetické informace z bakterie A. íumefa-cienx do rostlinného genomu je ojedinělým příkladem genetické výmény mezi organizmy z různých říší. Procesy, které přitom probíhají, však nejsou nijak výjimečné. Jedná se v podstatě o adaptace dvou proka-ryotiekých procesů: aktivace genové exprese v reakci na vnčjsí stimul prostřednictvím dvoukomponenlního pozitivního regulárního systému v bakterii a komutativní přenos T-DNA z donorové bakterie do reciptent- ori Obr. 16.8 Schematická mapa standardního onkngenního pla/midu 77 oktopinovrho kintíne AgrotniiUnum lumcfaciens, T-DNA, otv klopená pravým }. geny umocňující konjaejiivní pteno* Ti-piai-midu inu), ťcny kiUujíd kot.ititilizmus oklopiruj Ukc) a replikjční pocdliík pla/midu (,f'ri) 443 ní rostlinné buňky. Přenosové funkce jsou v A. titme-facierss kódovány plazmidovými i chromiizoniúl-ními virulentními Reny. V priibčhu procesu hojení dochází v poraněných rostlinných buňkách k syntéze ligninu z ťenolických prekurzorů, které slouží jako chemoatraktant pro bakterie A. htmefaciens a následnou indukci 7í-plazmidových virulentních (vir) genů. Bakteriální chromozomální virulentní geny {chvA u chvB) jsou exprimovány konstitutivně a zprostředkují zejména přichycení bakterií k rostlinné buňce prostřednictvím celulózových vláken. Virulentní geny lokalizované na ľí-pla/midu potom řídí a zprostředkují speciální reakce rozpoznávání rostlinné buňky a následné procesy vedoucí k přenosu T-DNA. Tylo geny jsou lokalizovány v jednom velkém regulonu v osmi operonech {virA až virtf). Geny virA a virG svými produkty pozitivně řídí transkripci ostatních v/r-genů: aminnterminální ěást virA-proteinu slouží jako senzorová doména interagující přímo s rostlin- nými signálními molekulami n předává signál virG-proteinu, který aktivuje ostatní vjr-geny. V transfor-maěním procesu hrají rozhodující úlohu hranice segmentu T-DNA, kicrč jsou tvořeny přímým opakováním ne zcela shodných 25pb úseků DNA. Jakákoli DNA lokalizovaná mezi těmito hranicemi může být transponována a integrována do rostlinných chromozomů, přičemž rozhodující úlohu hraje pravá hraniční sekvence (8^, right boundary), od které přenos T-DNA začíná. Produkt virDi-genu působí jako specifická nukleáza, která vyStépí pravděpodobně jediné vlákno T-DNA, jež je potom s pomocí ví>D2-proteinu transponováno do rosllinnč buňky Finálne je T-DNA integrována do rostlinného chromozomu procesem náhodné (ilegitimníl rekomhinuĽu. což zajišťuje její mitotickou i ineiotickou stabilitu. Detailní popis procesu přenosu T-DNA do rostlinných buněk lze nalézt v řadě specializovaných prací (napr. Ti n I and \99b). selQkCO vhodo&hc dono/ovehc druhu nebo rmitarau exprirmj-jiciho zadaný znak ctiaf akterlstika Funkce pfistLižnrhn ganu < 'jiOľ hamickä dráha) uoiac-e kMíi|i'ci sekvonca genu, jeho klonováVii •i placnrudu f. eofř kůrtÉtrukce chimérického genu s rostlinnými kontrol-nimi oblastmi 5' a 3-' klomváni chiméric*éha gaiiu do plazmidu s hraničními oblasi-mi T-DNA z Ti-plazmidu A tume" facŕens a signálními geny pro se lekci v bakieriích a rostlinách prenos plazmidu do bakterii A kitnttia&ens rwsoucleľl vxizhrofoný' ri-pWBtiild 1 infekce roaliŕiriýeh explamtátú bakteriemi A íiirrw/acřertí, následná eliminace bakterií antibiotikem r regenerace rostlin i iranslor rnovanych buněk v kulturách m viti a 2a prllúmnosti selekčního antimetabůlitu Základní Charakteristika primárních transgonnícn rostlin; a) bnchemlcký průkaz expresu signálního (selekčního) genu b) fyzikální důkaz priomnosli ■ntaklníTio iransgenu (DflA/D^-fivtifldltace, PCR) ti průkiLT transkripčniio produktu (RNA/DNA-hybrioYzace. RT-PCR) o) hirslocheflrilcl(áv'cytocliernická lokalizace trarret ripU. m sitii e) fcinkco enzymu kódovaného uam genem (průkaz enzymu nebo jim kataryzované reakce) t) fenotypový projev transejenu r sledováni slruktuml afunkini stabilfcy (segregace) iransgenu v Mnwihém potomstvu Obe. 16.9 Schéma cipciimeniälního postupu pro přenos cizorod^cli genů do rosil in pnjsířcdnjttvirn binárního systému Agrobncieťium liimcfncienx á rostlinných cxpbntátnvých kultur in viiro. 446 Původně vypracované postupy přenosu klonova-ných genů do TT-plazmidů byly poměrně složité; zahrnovaly několikanásobné konstrukce plazmídových vektorů obsahujících žádaný gen, signální geny pro selekci příslušných plazmidů v Escheňchici voli a fragmenty T-DNA v promiskuitních plazmidech, které byly vnášeny do A. tumefaciens, kde dvojitou homologní rekombinací docházelo k integraci do plazmidu. T-DNA však obsahuje onkogeny {iuaM, úuiH a ipí), které odpovídají za nadprodukci auximi a cytokininu a brání v regeneraci rostlin z transformovaných buněk. Proto bylo nutné tyto geny eliminovat h u ď mutací, nebo delecí. To vedlo ke konstrukcí vektorových Tí-plazmidů, kde velká část T-DNA je nahrazena úsekem malého plazmidu E. coíi, což. též umožnilo snadnou introdukci žádaných genů klonovaných v tomto pomocném plazmidu jednoduchou rekombinací. Objasnění funkce jednotlivých úseků 27-plazntidu dále vedlo ke konstrukci tzv, binárních vektoru, kde žádaný gen je klonován v malém plazmido-vém vektoru spolu s pravou hraniční sekvencí T-DNA a nezbytné produkty agrobakteriálních virulentních genů jsou zajišťovány 77-plazmidem v pozici trans. Těmito metodami již bylo dos;i/uio přenosu a exprese mnoha set prokaryotických a eukaryolických genů v rostlinách pod kontrolou konstitutivních i inducibil-ních promotoru, které mohou být rozpoznávány rostlinným transkripčním aparátem (obr. 16.9). Obr. 16.10 Stabilizovaní kultura nádorových kořenů ihairy roim\ in Hbv izolovaná po infekci rostliny tabáku iNicoiimui tahúcam) onkogenním kmenem Agrobatlerium rhizogritrs. Blízkým příbuzným A. tumvfaciens je Agrobacrc-rimn rhizogenes, které na místě poranění rostlin vyvolává tvorbu větvených kořenových struktur [hairy roots, obr. 16.10). Schopnost infekce A. rhizogmes je opět závislá na přítomnosti velkého onkogenního plazmidu (/J/, root inducing) a schopnosti jeho segmentu (T-DNA) včleňoval se do rostlinného genomu. Tento segment nese dva geny odpovědné za syntézu auxinu a dále čtyři geny (roiA, rotB, rolC a rolD), jejichž produkty působí synergicky a determinují morfologii kořenových nádorů. Kořenové nádorové kultury je možné pčstovat na syntetických médiích in vitro a mají potenciální využití v biotechnologiích (produkce kořenových sekundárních metabolitů). Na rozdíl od nádorů crown-gall jsou kultury hairy roots schopny regenerace v rostliny, které se však vyznačují charakteristickým změněným fenotypem (svraštěte listy, redukovaná apikální dominance, zkrácená inter-nodia; silné kořenění a snížená fertilita). 16.4,1,2 Rostlinné viry jako vektory Jinými prokaryotickými patogeny, které snadno pronikají do rostlinné buňky a jsou schopny se v ní replikovat jsou rostlinné DNA- a RNA-viry, Výhodou použití virů jako vektorů pro přenos genetické informace je schopnost systemiekcho šíření v rostlinách po infekci jejich částí a velký výběr virů s vhodným hostitelským rozmezím. Velkou nevýhodou virových vektorů je však jejich omezená kUmovact schopnost, autonomní replikace (nedochází kc kovalentnímu včlenění do rostlinných chromozomů) a skutečnost, že se obvykle nepřenášejí do semenného potomstva. Prvním virem, kterého bylo použito k přenosu cizího (bakteriálního) genu do rostlin, byl jeden z několika známých rostlinných dvouvláknovýeh DNA-viru, virus mozaiky květáku. CttMV (Brisson et al. 19K4). S RNA-viry jako vektory jsou manipulace sU vnější, neboť nejsou k dispozici techniky přímé konstrukce rekombinantních molekul RNA m vitro. Při integraci genů do RNA-virových genomů je proto nutné připravit zpětnou transkripcí cDNA kopii viru. Transformaci rostlin lze potom provést buď infekcí rekombi-naniní cDNA nebo jejími transkripty syntetizovanými in vitro. Tento postup byl poprvé experimentálně ověřen u jednodčložných rostlin pomocí RNA-viru mozaiky sveřepu, 8MV (French et al. 1986). Zvláštní metodou, která umožňuje vnášení virových genomů do rostlin ve fyiopatologickém výzku- 44^ mu, je agroinfukcĽ. Viro%ý gcnom (DNA u kaulirrm-viríi nebo cDNA u RNA-virů) je přilom klonován v několika tandemových opakováních di> T-DNA Ag-robacterium tumefaciens a vnesen do rostlin, kde re-kombinací me/.i kopiemi virové DNA dochází k jejich uvolnění a následnému vzniku infekčních virových částic. 16.4.1.3 Mechanický přenos klonované DNA Protože řada krytosemenných rosil in (zejména jedno-déložných druhu, včetně hospodářsky významných obilovin) riL-ní citlivá vůči agrobakteriální infekci, bylo vypracováno několik alternativních přístupů k vnáSení klonovaných genů do rostlin nebo rostlinných explantátů. Pokud je možné u těchto druhů regenerovat iz.olované proloplasty zpět v celé rostliny, jsou používány techniky permeabilizacc jejich cyto-plazmatické membrány elektrickým Sokem (elektro-poracc), kapilární mikroinjekce nebo indukovaného příjmu DNA s pomocí polyetylenglykolu (Potrykus 1990). Tyto techniky jsou využívány i k testování tranzieruní exprese vnášených chimérických genů, neboř k jejich expresi může docházet i před integrací do chromozomů. Nejnovější metodou je izv. mikropm-jektilový přenos DNA (parúcle bombardmení) do jader nebo organel kultivovaných buněk a případně i do intaktních rostlinných orgánů vslfelovánťm mikroskopických částic netoxických kovů (například wolframu nebo zlata), které povrchově adsorbovaly klonované molekuly DNA /. roztoku. 16.4.2 Sete kto vate Iné a reportérové geny Velkým zdokonalením vektorů je vyžití dominantních signálních genů, které umožňují selekci trans-gcnm'eh buněk i rostlin na základě získané rezistence vůči antimetabolitům (např. kanamycinu, hygromyei-nu, bleomycinu nebo mctotrexátu) nebo monitorováním transgcno/e biochemickou detekcí reportérového enzymu (např. chloramfenikolacetyltransferázy, /í-glu-kuronidázy. Iuctferázy); jejich přehled je uveden v tab. 16.3. Dominantní signální geny jsou připravovány in viiro jako chimérické konstrukty fúzí promotorů eukaryolickčho typu a vhodných terminátorů transkripce se strukturními geny kódujícími signální Tab. 16.3 Přehled dominanlriích scIi-kiovLiielnvtii a rcpoiícVuvych genu (možrKHl snadného biochemického testu) v genovém inienýr--i--. i i. .- li.i i ■ \ r tnutí navození rezistence k dané láurc. Cen Donor 1 "filial iťleUe Test als aoelolali U syrnä/a (dilorvutiuron'J Artihitliipfis ihaliittui nüMm k fhlorsulfuronu - tirrtA 5-enolpyruvy liiki-mít-J-foifiliynlizu. tílyfoříť) Saimtmttla typhimurium rezistence kc glyfo/Jiu bar fosfinotricin-.icel>)ti jn>ru-i iir.j Strtpttitnyces re ristence k. bialaphosu + ble Escherichia coli (Tn5> rezistence k hlcomyeinu - lnu rJUHiionynilmiriliza Klctnitlla 1 '..If k t>romv\ym)u - dihydrofolírreduk-[i?j (nctotraiť) E. coli . Mtt.i musfatm rezistence k mertrfíc udiv cal chkmumfenikol-wQrttriBtfaiu E. coli - sfp zeleni fluoreskujíci pHHnn Attfuorta viaariti - + i.-,. iitulAí /tplukuncmidäza £ ealU (Kil) - + hph hygromycin Ibtfotnufafu E r fli ípJR225) rezistence k hygrnmycirui It + lat/. /i-pJakiořidin E. coli + toc. lux .1 . ii: ; i ■ FIH'I\IIU.\ pyralis, Vibritt tiantyi + Irpl 1. i\pt II rteumycin-fosfoUarisfcriii I, II E. coli (TnfiOI. Tn5) flľMMenct k* kanamycinu + slreptomyc i n-ľusfoti .m --(<.■ -.i a. F. taŮ (Tni) Teti stent* k strrptomycinu — suli dihydropleri>íSisyri-líza (íu-lfortaitiid1) L coli i pH ■:(■■' rezistence k iulfrtmrnidu - itlc trypinfíin-dekarboxyllu CatharaMhtis roseus rezistence k 4-meryl-1.: |"['.-i..ii.i .■/i rif,:. í(-f\vkitt.\ilú.a '/ja mayi - + OCt, ntts okictpinsymaTa. no|Mlin&ynüiza Afirttltaclerium iHmrJtn lens _ + + iciííM iiioH tryntofan-monooxygemí/ÍP. in Joly lacei • apmdhydrolíza A. imnrjafitns ríist bez auxinú •l" izopcnlenyl-r r :i-i v:. ■! :i A. iitmeftuiens fúM bez cyinkininů - 448 enzymy. Nc|čnstčji používanými konstitutivními pro-motory v genových manipulacích u rostlin jsou 5'-se-kvence opinsyntázových genů / 77-p!azmidu A. tume-faciertxa 35S RNA-promotnr z viru mozaiky květáku {CuMV). Z rostlin byla izolována i řada promotorů, které umožňují specifickou expresi genů v určitých orgánech nebo pletivech; například promotor genu kódu-jícího semenný protein fazeolin je funkční pouze v dě-ložníeh lístcích, gluteninový promotor vendospermu, patatinový promotor v hlízách nebo promotor Rubtsco-genu v Ěistcch při světelné indukci. Nejrychlej5í technikou užívanou k testování funkce těchto promotorových sekvencí je sledování tranzientní exprese klonova-ných chimérických genu po jejich indukovaném příjmu (např. elektroporací) v rostlinných protoplastech. 16.4.3 Strategie využití protismyslných genů Strategie využití tzv. protismyslných Umtisense) sekvencí nukleových kyselin je založena na blokování informačního loku z mRNA do proteinu aplikací vlákna RNA komplementárního k sekvenci cílové mRNA. Experimentálne je toho obvykle dosaženo „obráceným" nakloňováním příslušného genu pod vhodný promotor, začlenením tohoto konstruktu do J-DNA v agrobakteriálním vektorovém systému a jeho přenosem do rostlin. V transgenních rostlinách se pak syntetizuje protismyslné vlákno RNA, které na základe párování bází tvoří s „normální" mRNA duplexy, jež jsou rychle degradovány, nebo je mRNA poškozena pfi post t ran skřípení úpravě, případně je jinak blokována translace (obr. I6.ll). Tento proces je v některých případech součástí přirozeného regulačního systému u prokaryot i eukaryot, kdy se ivoří krátká komplementární vlákna RNA, inhibující funkční transkripty v určitém stadiu ontoge-neze. První pokusy se syntetickými protismyslnými geny byly prováděny pomocí tranzientní exprese v izolovaných protoplastech: introdukované protismyslné geny svými transkripty inhibovaly expresi příslušných signálních genů, Protismyslné geny jsou schopny i blokovat nebo redukovat funkci přirozených rostlinných genů v transgenních rostlinách, jak to bylo prokázáno například u syntézy flavonoidů v květech nebo polygalakturonázy a etylénu ve zrajících plodech. transkripce "normálního" genu v rostlině transkripce obrácené nakloňovaného (protismyslného) genu v rostlině 3" ( + ) vlákno DNA pfomwor pclyW 5' (-) vlákno DNA 3' transkripce I' í«rti« mRNA 3' ( -) vtákno DMA promotor 5 ■ (+) vlákno D+iA transkripce srMttertsp HNA nehjrrtcni duplo* HNA-RNA Ohr. Iťs.l I Schéma strategie využití protismyslné {amisen/se) RNA k inhibici exprese endogenních rostlinných jjenú. V normálních rostlinách (jakož i v ostatních prokaryotických a cukaryotických organizmech) v/nikají príslušne mRNA přepisem jediného vlákna dvou-iroubovicc DNA (izv. minus-vlákno neholí tense ítmnd, značeno čárkované). Pokud je gen nakloňován pod promotor ohrácene. je přepisováno plus-vlákno DNA {anúsrnsc stranei. značeno tečkovaní), Po vnesení (tikového chimérického fcnu do rostliny (například pomoci jtgrohaklerĽilního vektoru) vzniká v rosllinnýcli buňkách pioiiMriyslnii RNA (antisenseRNA\ klerd maJe $pfftlulnou normální rostlinnou mRNA na základe párování há/í vytvářet duplexy, íi lim znemožňoval proces trans.la.ee. 449 16.4.4 Strukturní a funkční stabilita transgenů Fyzická přítomnost transgenů a jejich počet kopií v rostlinném genomu jsou ověřovány Southemovou (DNA/DNA) hybrid i zací nebo technikou PCR, jejich exprese je zjišťována pomocí RNA/DNA-řtyhridizace ;t imunologických metod detekce- příslušných poly-peplidů, případně jednoduššími enzymovými testy, při nich/ jsou in vitro nebo in siru detekovaný finální produkty signálních enzymových reakcí (obr. 16.12), 3 if! w •< 1 1 1 Obr. 16.12 r/f) z Escheriihia cirli. navozující rezistenci ke kana-mycinu. Semenáčky rostoucí na syntetickém médiu s kanamycincm ic^Jť^u|l nu kiinamycin-iezistenmí a kaniímvťin-sťnzilivní rostliny v mcndclistiekém statistickém pointru 3:1. U senzitivních rostlin ve efekt kjiumyeinu projevu je retardovaným vývojem, blokováním syntézy chlorofylu a pozdější k-talitou na úrovni vývinu déloinich lístku (tyto rostlinky jsou n/naecny Šipkami), (b) Biochemické stanoveni en/ymu neomycinfosfolrunsícrá/y v transgcnníeh rostlinách t.lbáku. Proteinové extrakty z rostlin jnu eleklroforctieky separovány v akry I amidovém gelu a na nem jc in fint provedena ..sendvičová" reakce za přítomnosti substrátu (kanamycinu) a donoru fosfátových skupin ("P-koncové značeného adenoz.inlrifos.fitu. ATP) Výsledný produkt, fosforylovaný kuuamycin, oz.nurcný šipkou, jc vi/ual i/ován autoradiograficky na rentgenovém filmu. Vzorek \ diáze OisId I je negativní kontrola (normálni lakšk.i. nansgcnni vzorky číslo 2 a 5 mají vysokou Kladinu enzymu, vzorek číslo 3 jc velmi slabě pozitivní a vzorek v drizc číslo 4 cnz.ym neobsahoval (zjevné došlo k „umlŕcní" iiansgenu> I když strukturní stabilita transgenů v rostlinách jc v/hledem k jejich integraci do chromozomů vysoká, dochází často k jejich i n aktivaci zejména v případě přítomnosti více kopií" transgenů. K této inaktivaci, která je obvykle provázena metylací jejich promotorů, může docházet, pokud jsou transgeny organizovány jako tandemová opakování (cví-inaktivace) nebo jeden metylovaný (ransgcn může inaktivovat jiný v pozici trans mechanizmem analogickým u puramutaeí. případně může docházet ke koordinovanému ,,umlčování'" dvou nebo více homolognfch transgenů (co-sup-pression, Matzke a Matzke 1995). Procesy inaktivace založené na úplné nebo částečné homologii úseků DNA transgenů probíhají na úrovni transkripciu nebo posttranskrtpční. Předpokládá se, že párování homo-lo^nťch sekvencí může způsobovat inaktivní genetický stav de ŕirjvo-metylací a heterochromatinizací UrunskripĚní inaktivace) nebo mRNA-produkty více transgenů se akumulují, až dosáhnou kritické hladiny, při které dochází k jejich rychlé degradaci (post-transkripční inaktivace). „Umlčování" transgenů v rostlinách je dnes Široce využíváno jako modelový systém ke studiu interakcí homo lot; n ich sekvencí DNA, neboť by k němu mohlo docházet i u endogenních genů, zej menu v polyploidnfch rostlinách, Z praktického hlediska je však ..umlčování" transgenů určitou překážkou při aplikacích technik genového inženýrství v biotechnologiích a šlechtitelské praxi. 16.4.5 Transgenoze jako nástroj ke studiu fyziologických a morfologických procesů Pokroky v konstrukcích ugrobakieriálnich vektorů a regeneraci rostlin v explantátových kulturách in virrn vedly v průběhu posledních několika lei k přenosu mnoha prokaryotických a eukaryotickýeh genu do rostlin. Níže popsané výsledky jsou současně příklady, jak metodami genového inženýrství lze studovat nebo modifikovat fyziologické a morfologické procesy v rostlinných organizmech. 16.4.5.1 Modifikace obsahu rostlinných hormonů Řadu. druhů, mikroorganizmů {rcjména lyiopulogcnní bakterie) produkuje rostlinné hormony auxinovcho nebo cytokininového typu, i když metabolické dráhy. 450 které vedou k biosynté/e těchto látek, nemusejí být v rostlinách a bakteriích shodné. Syntéza rostlinných hormonů, auxinu a cytokinínu, kódovaná T-DNA původem 7. onkogenních plazmidů Agrobacterium twne-faciens je podmínkou pro aktivitu těchto bakterií jako fytopatogenů- Agrobakteriálnf geny odpovídající za syntézu auxinu a cytokinínu nejsou homolognf s geny, které kódují enzymy katal y zující syntézu hormonů v normálních rostlinách. Jednou /. možností využití genového inženýrství ke studiu biologických funkcí rostlinných hormonů je vnášení genů odpovídajících za jednotlivé kroky v syntéze (popŕ, v degradaci nebo jiné chemické modifikaci) rostlinných hormonů z A. lumefaciens á A. rhizogťrtťs, prípadne i z jiných druhů bakterií {Pseudomonas synngae subsp, savastanoi, Xtmthamonas campestris, Rhizobium sp. aj.). Cytokininy Produkt jednoho z agrobakteriálníeh onkogenů, izo-penlcnyLtransfcrázy {ipt)t která kondenzací izopente-nylpyrofosfátu a adcnozínmonofosfálu (AMP) dává vznik izopentenyl-AMP, je pravdepodobné klíčovým enzymem v biusyntéze cytokinínu; izopentenyl-AMP je rostlinou rychle transformován v biologicky aktivní cytokininy, zejména deriváty zcatinu. Gen kódující izopentenyltransferázu z A. tumefaviens byl se silným promotorem z viru mozaiky květáku vnesen do rostlin tabáku. Tylo transgenní rostliny mají až stonásobně vyšší hladinu cytokinínu ve srovnání s normálními rostlinami a vykazují ztrátu apikální dominance, potlačování procesu stárnutí a zejména neschopnost tvorby kořenů. Gan a Amasino (1995) izolovali z Arabidopsis tha-tiana gen, který1 je cxpnmován výhradné při procesu stárnutí listů. Promotor tohoto genu pak nakloňovali ke strukturnímu a gro bakteriálnímu genu kódujícímu izopentenyltransferázu (ípf) a tento chimérický gen vnesli do rostlin tabáku. Jakmile v listech trans-genních rostlin nastal proces stárnutí (který normálně vede k jejich programované smrti), došlo k indukci syntézy cylokininů, tím bylo stárnutí potlačeno a listy dále vykazovaly fotosyntetickou aktivitu. Akiivita transgenu byla tedy řízena autoregulačním mechanizmem a rostliny nejevily žádné nežádoucí symptomy nadprodukce cytokinínu ínapr. neschopnost tvorby kořenů). Tato práce je názorným příkladem, jak je možné pomocí transgenoze ovlivnit procesy stárnutí rostlin. Estruch et al. (199h provedli transformaci rostlin genem ipít do něhož byl mezi promotor a kódující oblast genu vklonován mobilní genetický element Ac z kukuřice. Takto upravený gen je exprimován pouze v případě, kdy dojde k vyštěpení Ar-clcmentu. Pokud k vystúpení transponovatelného elementu došlo až v pozdější dobĚ vývoje rostliny a pouze v některých oblastech prýtu. rostliny byly schopny tvořil kořeny. Vysoká hladina cytokinínu v listech odrážela vyšší četnost transpozíce Ať-elemcnlu a mela za následek tvorbu drobných výhonků prýtů na okrajích listů (vi-viparic). Květní pupeny dávaly vznik abnormálním květům s vysokým obsahem cytokinínu, avšak s výrazně nižší hladinou Iranskriptů některých homeotic-kých kvělních genů. Tyto výsledky naznačují, že cytokininy mohou řídil aktivitu homeotických genů, a tedy i vývoj květních orgánů. Auxiny Binsyntéza auxinu v nádorech crawn-gall probíhá poněkud odlišně než v normálních rostlinách. Produkt agrobakteriálního genu iaaM katalyzuje přeměnu tryptofanu v indolyl-3-acetamid, který je pak konvertován ve výsledný auxin (indolyl-3-octovou kyselinu, IAA) prostřednictvím enzymu indolyl-3-acetamid-hydrolázy, který je produktem genu iaaH. Jelikož indol yl-3-acetamtd není obvykle meziproduktem bio-syntézy auxinu v rostlinách (tím je u rostlin indolyl-3-acetaldehyd), musí být v nádorech crown-gali funkční oba agrobakteriální geny. iaaM a iaaH. V testovaných transgcnnícb rostlinách vede exprese genu iaaM s pomocí silněnu promotoru k určitému zvýšení syntézy auxinu, zatímco exprese samotného genu iaaH nemá řádný účinek. Ke studiu biologických funkcí auxinu byl do rostlin mrkve vnesen agmbakteriální T-DNA-segment, který obsahoval gen iaaH se svým vlastním konstitutivním promotorem, zatímco gen iaaM byl nakloňován pod kontrolu tepelně in d u kováte! ného promotoru z mouchy octomilky (Orosnphila metáno-gaster). Vystavení transgenních rostlin zvýšené teplotě pak bezprostředně vedlo ke zvýšení hladiny auxinu a indukci tvorby kořenů Gen iaaL, izolovaný r. bakterie Pseudomonas syrin-gae subsp. savastanoi, kóduje enzym IAA-lyzinsynte-tázu, který katalyzuje konjugaci lyzinu a IAA. Kon-jugáty IAA s aminokyselinami se vyskytují i v rostlinách, avšak konkrétně konjugát IAA s lyzinem tu není obvyklý. Spěna et al. (1991) nakloňovali gen iaaL 451 pod vhodný promotor za iíčdem studia, zda konjugace IAA k ly/inu ovlivňuje biologickou aktivitu au-x in u v rostlinách. Získané transgenní rostliny tabáku a brambor j vykazovaly nékteré fenotypové odchylky charakteristické pro sníženou hladinu auxinu: částečné potlačený vývoj kořenů a ohyb řapilu a střední listové žilky (c-pmaslie}, Etyfen Technika transgeooze umožnila potlačení syntézy endogenního rostlinného hormonu etylénu, který mj. urychluje zTánť plodů. Etylen je chemicky nejjedno-duSSÍm známým hormonem a jeho metabolická dráha metionin (SAM-&yr"itĎtáza) 5-adertozyl-L-maltonirt (SAM) mťíiyliKiadůnoiin + fKwnoswin <_ (SAM-hyťfúláza z EsctWriChia Culí} aiitisense ACC-syniáza iACC-Syfůézs) amlnocyWopfspan-T-iíjutwxylova kyselina (ACC) íj-ketortjselná kysi-L,: < ..... ffflfrSSílSS ACC-ůxidáf a (ACC-nxicraza| eiylen Obr. |{j,]3 Inhibiťc syntézy clvltnu v roHlItniĽh prmltedniLtvím technik genového mícnýr&tví. Schéma íe pí j rentuje iMmIuí biu-ijmteticlom dráhu etylénu («) mel ion tnu přes; SAM a ACC) a moí-nusii .fiíjího Niuuicní potiaiCäfiiin A C \ n(.i,-';,. prípjJne ACC-ňxi-da/y. prostřednictvím pnotisniystných genů nebo degradací mc/ipniiJuktů hynlií/v elytcnu po vnesení junu: KikLcri.ilnflio původu {SAM-hydrolaza nebo ACC-dcaminá/j). v rostlinách je již zcela objasněna. Výchozí látkou je metionin, který spolu s ATP dává vznik S adenozyl-i.-metiortinu (SAM), jenž je dále konvertován v amino-cyklopropar- I-karboxylovou kyselinu (ACC) s pomocí enzymu ACC-syntázy. Finální reakcí biosyntézy etylénu jc oxidace ACC na etylen (C:H4), katalyzo-vaná ACC-oxidázou (viz kap. S). Klíčovým meziproduktem je tedy SAM, který se uplatňuje i v jiných metabolických drahách (zejména jako univerzální donor metylových skupin), Good et a!. (1994) připravili transgenní rostliny rajčete, do kterých vnesli SAM-hydmlázový gen z bak-terioťágu 7'.í Esckerichia coli. Ij!n/.yrn SAM-hytln>lá?a kata lyžuje rozklad SAM na metylttoadenozin a homo-ser in, což má za následek kritický nedostatek SAM pro řadu bunečných reakcí. Aby nedocházelo k některým nežádoucím poruchám metabolizmu rostliny, byl gen kódující SAM-hydrolázu nakloňován pod kontrolu tkáňové specifického promotoru, který jc aktivován pouze v průběhu zrání plodů rajčete. Výsledné IranSgcnní rostliny se vyznačovaly normálním fenoty-pem. avšak syntéza etylénu ve zrajících plodech byla silné redukována, což mčln /a následek požadované brzdění přezráváiií plodů. Inhihice syntézy etylénu by In dosaženo í jinými sirntegiemi genového inženýrství: konstrukcí trans-genních rostlin nesoucích protismyslné geny, jež inhi-bují expresi rostlinných genů kódujících enzymy ACC-syntázu nebo ACC-oxidázu, případné přenosem bakteriálního genu ACC-dcaminázy (obr, I6J3). 16A5.2 Regulace rnetabotizmu sacharidů Škrob je hlavním rostlinným zásobním polysachari-dem. který se ukládá ve formč zrn v amyloplastech a chloroplastech, kde probíhá i jeho biosymčza. Jedním z prekurzoni škrobu je adeiioztndiťostátglukrtza (ADP-glukoza), jejíž tvorba z glukóza-lďosfátu a ATPjc katalyzována entymem ADP-glukozapyro-fosforylázou (AGPáza). Dřívej Si studie potvrdily, Je ADP-glukúza je výhradním prekurzorem hiosyntézy Škrobu, neboť mg taní v se sníženou hladinou AGPázy izolované u kukuřice obsahovaly v endospermu obi-lek výrazně nižší obsah Škrobu. Miillcr-Robcr et id. (1992) připravili transgenní rostliny bramboru, ve kterých byla exprese AGPá/,y inhibována vnesením chimérického protismyslného gen a pod koni rolou silného konstitutivního promoto- 452 ru, Transgenní rostliny vykazovaly sníženou hladinu AGPázy v listech i hlízách. To m č to za následek potlačení syntézy škrobu v početných malých hlízách, kde docházelo k hromadení sacharózy a glukózy. In-hibice AGPázy neovlivnila hladiny jiných enzymů, které se účastní syntézy škrobu, došlo vsak k významné redukci exprese zásobních hlízových proteinů (zejména pa táli nu), což naznačuje souvislost mezi syntézou zásobních látek, škrobu a bílkovin, v bramborových hlízách. Do rosilin byl také vnesen gen glgC z Escherichia coli, který kóduje bakteriální enzym AGPázu (Stark et a). \992). Aktivita tohoto enzymu je regulována jinými ejektorovými látkami než aktivita obdobného enzymu v rostlinách. Transgenní rostliny bramboru obsahovaly vyíší množství škrobu ve svýeh hlízách, docházelo zde tedy ke zvýšenému přísunu organického uhlíku. Tyto výsledky naznačují. Že účinnost ťo-tosyntetické asimilace vzdušného oxidu uhličitého může být regulována i aktivitou enzymů podílejících se na syntéze škrobu, tedy schopností využívat foto-syntetické prodá kly formou tvorby zásobních polysacharidu. 16.4.5.3 Modifikace syntézy rostlinných lipidů Nejčastůjšími rostlinnými lipidy jsou eslcry glycerolu a mastných kyselin (triacylglyceroly neboli triglyce-ridy). které se akumulují jako zásobní látky v semenech a plodech některých druhů rostlin a představují významný komerční zdroj tuků a olejů. Fyzikální a chemické vlastnosti lipidů jsou závislé na složení mastných kyselin a jejich distribuci na skeletu glycerolu, Včtšina z více než 2(K) známých mastných kyselin je syntetizována pravé v rostlinách; nejhojnéj-Šími jsou kyseliny palmilová, stearová, olejová, linolová a tinolenová. Kyselina Imolova je napríklad esenciální složkou potravy savců, nebof savci nejsou schopni desaturovat olejovou kyselinu, která má ve svém uhlíkatém rclčzci jedinou dvojnou vazbu, na kyselinu linolovou, která mádvé dvojné vazby. Biochemie lipidového metabolizmu je velmi složitá, je v ní zahrnulo víee než tficet enzymů, které kata lyžují reakce od acetylkoenzymu A až k výsledným produktům. Klasickým šlechtěním rostlin jsou z řepky olejky odstraňovány nežádoucí mastné kyseliny s dlouhým uhlíkatým řctčzcem (např. kyselina eruková, která má ve své molekule 22 atomů uhlíku). Syntéza kyseliny erukové je řízena dvčma geny bez vzájemné dominance, které působí adilivnč a prodlužují uhlíkaté řetězce mastných kyselin, V posledních letech již byly izolovány některé geny, jejichž produkty sc účastní syntézy mastných kyselin a lipidů, a tyto geny byly pod kontrolou specifických promotorů, aktivních pouze v rostlinných zásobních orgánech, vneseny do rostlin (Topfer et al. 1995). Prvním úspéchem genového inženýrství bylo zvýšení obsahu nasycené mastné kyseliny stearové na úkor nenasycené kyseliny olejové prostřednictvím strategie exprese protismyslného desatúrazového genu u řepky. Stejného cíle. tj. zvýšení obsahu kyseliny stearové, bylo dosaženo nadprodukcí tioesterázového genu izolovaného ze sóji. Naopak zvýšený obsah kyseliny olejové je požadován u fepky i jiných olejnín pro průmyslové využití; toho bylo dosaženo v trans-genních rostlinách řepky po vnesení protismyslného genu oleátdesaturázy. Podobné výsledky byly demonstrovány u sóji, kde byla zvýšena hladina linolenové kyseliny v semenech inhibicí linolátdesaturá/y prostřednictvím protismyslného £enu. 16A5.4 Produkce proteinů v transgenních rostlinách Modifikace aminokyselinového složení zásobních proteinů Zásobní proteiny prol aminové ho typu u řady obilovin (např. pšenice, ječmene, kukuřice) mají nízký obsah lyzinu. zatímco zásobní proteiny leguminóz mají málo sirných aminokyselin. Ke zvýšení kvality /áviih nich proteinů u rostlin bylo navrženo nčkolik strategií. Jako nej perspektivnější je možné považovat přístupy proteinového inženýrství; cílená nuiu^cne/u si:i\;.i-i-cích genů in vitro a jejich zpčtný přenos do rostlin, prípadné i vnášení optimalizovaných syntetických genů by měly vést ke tvorbe proteinů se zvýšenou hladinou esenciálních aminokyselin (Jayneset al. I9R6). Problémem je však zajištční stability takto modifikovaných proteinů v rostlinných pletivech i jejich zmenené fyzikálně-chemické vlastnosti. Druhou alternativou je zvýšení syntézy jiných typů vlastních zásobních proteinů, které jsou bohatší na obsah limitních aminokyselin. Ke zvýšení obsahu esenciálních aminokyselin v zásobních proteinech semen u obilovin jc nutné též vypracovat metody regenerace a transformace in viiro. 453 Produkce protiiátek v transgenních rostlinách Byly zkonstruovány chimérické' geny, které obsahují kódující sekvenci z a-amylázového signálního pep-tidu ječmene, fúzované s cDNA, jež kódují lehký a těžký řetězec savčí monoklonální protilátky. Do expresního vektoru byly klonovány oba geny současné a po vnesení do rostlin tabáku byla uvnitř jejich en-doplazmatického ret i kula prokázánu funkční agregace obou řetězců protilátky. V analogických studiích byly cDNA odvozené z myífch hyhridomových mRNA vneseny do tabáku, transgenní rostliny exprimující jednotlivé y- nebo K-imunoglobulinové řetězce byly spolu kříženy a daly vznik potomstvu, ve kterém oba řetězce byly exprimovány současně (Hiatt et al. ]9Hl>). Tylo pokusy naznačuji Siríi mo/.nosti využití protilátek v rostlinném výzkumu. Vazba protilátek k malým molekulám (např, toxíny, hormony, herbicidy), které prostupují bunečnou stěnou, by mohla vest k rete ne i těchto molekul v určitých částech rostlin a mohla by se uplatnit i při studiích interakcí rost-lina-patogen. Zlepšeni chuťových vlastnosti rostlinných potravin Některé tropické rostliny vytvářejí ve svých plodech specifické bílkoviny, které se vyznačují schopností vazby na chuťové receptory savců a vyvoláváním pocitu sladkosti; jsou až lOOÍXIOkrát „sladší"1 ncl sacharóza. Jedním ?. těchto sladkých proteinů je monelin, akumulující se v plodech africké rostliny Oioscoreo-phylUtrn cumminsii. Monelin je tvořen dvěma peptidy vázanými nekovalentními vazbami, klcré jsou za zvýšené teploty nebo v kyselém prostředí nestabilní. Pe-narrubia et al. (1992) vSak připravili syntetický tr.cn, který kóduje oba peptidy v jediném peptidovém řetězci za sebou. Produkt tohoto genu je stabilnější než původnf dvouřetězcový monelin a nemá žádné mutagenní nebo cytotoxické vlastností. Gen byl nakloňován pud kontrolu konstitutivního promotoru a vnesen do rostlin salátu a dále pod promotorem, který je aktivován pouze ve zrajících plodech, byl vnesen do rajčete, V obou případech docházelo k očekávané akumulaci příslušné mRNA a peptidu monelinu. Tvorba monelínu v transgenních rostlinách lak reprezentuje netradiční přístup ke zvyšování chuťových a jiných kvalitativních vlastností rostlinných potravin. Představuje též možnost vysoce efektivní bioprodukce alternativního sladidla expresi monclinového genu v transgenních rostlinách nebo mikroorganizmech. 16.4.5.5 Regulace kveteni a fertility květů prostřednictvím t ran sg e noze indukce samčí sterility chimérickým RNázovým genem Jedním z důležitých šlechtitelských cílů je navození samčí sterility k usnadnění přípravy hybridního osiva. V samčích pohlavních orgánech, prasnicích, se tvoří až několik tisíc specifických mRNA. Klíčovou roli při tvorbě pylu hraje prašníkové výstelkové pletivo (tapc-tum), kde se tvoří mnoho specifických proteinu a jiných látek, které vyživují vyvíjející se pylová zrna nebo se stávají složkami stěny pylových zm. Klasickými Šlechtitelskými postupy již byla izolována řada různých cytoplazmatiekých a jaderných mutací bránících vývinu pyhi a /pusobujících tak samčí sterilitu. Pomocí technik genového inženýrství byla izolována promotorova oblast jednoho tabákového genu specificky funkčního pouze v prašníkovém tapetu a tato sekvence byla fúzována s RNázovými geny izolovanými z Aspergillus oryzae a Bacillus amyloliquefa-ciens. Tyto geny kódují RNázu, enzym, který nespecificky atěpí molekuly RNA. Pomocí agrobakieriál-ního vektoru byly tyto konstrukty vneseny do tabáku a řepky. Exprese chimérických RNázových genů selektivně deštruovala tapetum při vývinu prasnfku, bránila tvorbě pylu a vedla k rostlinám se samčí sterilitou (Mariáni et al. 1090). Inhibice tvorby květů protismyslným genem k mitochondriálnicitrátsyntáze Cyklus kyseliny tri karboxylové (citrálový cyklus, viz kap. 5) je klíčovým procesem metabolizmu mituchon-drií u eukaryotických organizmů včetně rostlin. Ke studiu biologické funkce tohoto metabolického cyklu byl použit protismyslný gen k mitochondriálnímu enzymu citrátsyntáze, který katalyzujc první krok v cit-rátovém cyklu. Transgenní rostliny bramboru expri-movaly protismyslnou RNA a docházelo ke snížení hladiny enzymu citrátsyntázy. V průběhu vegetativního růstu byly tyto rostliny nerozlišitelné od kontrolních, avšak indukce kvetení byla u transgenních rostlin opožděna a květy abortovaly již v počátečních stadiích vývinu (LandschUtze et al. 1995). Mikroskopická analýza deťektních poupat prokázala zejména abnormální struktury v semeníku. Mechanizmus 454 účinku snížené aktivity mitochondriálm' eiirátsyntázy na samici sterilitu tedy bude zásadne odlišný od jiných milochondriálních defektů (zejména od redukované schopnosti syntetizovat ATP v průběhu vývinu pylu nebo celých praSníků), ktcré vedou k samčí sterilite (i/v. eytuplazmalická samčí sterilita). Modifikace kvetní morfologie prostřednictvím homeotických transgenů Homeotické geny kódují transkripční faktory, které se rozhodujícím způsobem podílejí na aktivaci genů řídících procesy diferenciace a morfogeneze (viz odd. 16.3.1). Řada homeotických genů ovlivňujících kvetní morfologii již byla izolována a některé z nich byly prostřednictvím agrobaklcriálních vektorů přeneseny do jiných druhů rostlin. Z řepky olejky (čeleď Brassi-caceae) byl například izolován gen againous, jehož exprese je přísně regulována a který normálně odpo-vídá /.a tvorbu orgánů třetího a čtvrtého květního kruhu (tyčinky a pestíky). Tento gen byl po nakloňováni pod silný konstitutivní promotor vnesen do rostlin tabáku (čeleďSntanaceae). Transgenní rostliny vykazovaly předpokládané homeotické květní transformace: přeměnu sepal v pestíky a petal v tyčinky (Mandel el al. 1992), Transkripční faktor tvořený genem agamous, odpovídající za tvorbu pohlavních orgánů, byl tedy vlivem nespecifického (konstitutivního) promotoru tvořen i v „nepatřičných" pletivech základů kalichu a koruny, kde aktivoval geny determinující tvorbu tyčinek a pestfků. Tato práce demonstruje možnosti cílené modifikace struktury květních orgánů i vysokou fylogenetickou stabilitu rostlinných transkripěních faktorů 16.4.6 Další cíle transgenoze ve šlechtění rostlin Pokud se týká uplatnění transgenoze ve šlechtitelských programech, největSfho pokroku bylo dosaicno v navození rezistence vůči virovým chorobám a herbicidům; k dalším dílčím úspěchům palří přenos genů odpovědných za odolnost vůči pozorovánu luny/u, brzdění předčasného zrání plodů, produkce farmakologicky významných látek aj, Řada významných plodin (zejména kukuřice, tabák, brambor, bavlník, řepka a sója) s takto geneticky modifikovanými vlastnostmi již byla uvedena do zemědělské praxe. 16.4.6.1 Zvýšení odolnosti rostlin vůči virům Jednou z klasických Šlechtitelských meiod s cílem navození rezistence vůči virovému onemocnění je izv, křížová ochrana icross-profecúan), spočívající v in-okulaci rostlin oslabeným virem, který pak potlačuje replikaci superinfikujícího patogenního viru. Podobného principu bylo využito i při konstrukci transgen-ních rostlin se sníženou citlivostí vůči viru mozaiky tabáku (TMV), Pomocí reverzní transkripce RNA genu TMV, kódujícího plášťový protein, byl připraven a přenesen do rostlin chimérický gen, který v trans-genních rostlinách produkoval virový plášťový pro-tein. Mechanizmem, který nebyl dosud zcela objasněn, dochází v transgenních rostlinách po virové infekci k inhibici virové replikace nebo alespoň k její redukci. Jiný směr genového inženýrství ve šlechtění na rezistenci spočívá v inhibici genové exprese RNA-virů v transgenních rostlinách prostřednictvím vnesené protismyslné RNA. Další strategie je založena na existenci satelitních RNA jako virových parazitů. Tato satelitní RNA může u některých virů provázet jejich infekci, čímž alespoň částečně potlačuje virovou replikaci i expresi symptomů choroby. Transkripce ktonované cDNA virového satelitu v rostlinné buňce vede po infekci k enkapsulaci satelitní RNA do virových Částic a zpomalení replikace viru, rixperi-mentálně jsou lestovány i další možné mechanizmy obrany vůči RNA-virům, zejména využití ribozymú, které štěpí specifické sekvence ribonukleolidů virového genomu. 16.4.6.2 Transgenní rostliny toxické k hmyzím predátorům Bacilhss iluiringiensis je bakterie, jež v rané fázi spo-rulacc vytváří krystalická proteinová tělíska obsahující protoKin, který po rozštěpení v alkalickém obsahu střev je toxický pro larvy motýlů, případně jiného hmyzu (Aronson et al. 19Hfi). Geny, které tento protoxin kódují, byly s pomocí agrobakteriálních vektorů vneseny do rostlin tabáku a rajčete s cílem intoxikace jejich hmyzích predátorů. Zatímco exprese celého protoxinového genu měla pro vlastní rostliny letá lni efekt, introdukce fragmentu tohoto genu byla rostlinami tolerována a hladina toxického proteinu tvořeného rostlinou byla dostatečně vysoká na larvy hmyzu. Z jiných typů B. thuringk-mis jsou izolovány 455 geny kódující specifické to x my vůči broukům a konstruovány ehimérické geny k navození rezistence rostlin napr. k mandelince bramborové. Jako reakce na požer hmyzem nebo mechanické poranení dochází u některých druhfi rostlin (například z čeledí Sr/líuiticťae nebo Vjfťítjcftjť) k indukci syntézy setinových protcinázových inhibitorů, které narušují trávicí procesy predálořů, a představují lak rostlinný obranný mechanizmus proti nim. Například gen kódující try psi nový inhibitor jíž byl izolován a po-moeíagrabakleriálního vektoru vnesen do jiného rostlinného druhu, kde po požeru způsoboval hynutí larev motýlů. 16.4.6.3 Transgeny jako indikátory aktivity induktorů rezistence Rostliny mají vyvinuty četné mechanizmy k obraně vůči biotickým i abiotickým stresům (kap. 15). Patří mezi ně například syntéza řady chemických látek nebi I k ovin ne (inhibitory proteinů, antibiotika, lan i n y, fytoaleitiny, alelochemické sloučeniny, nligogalaktu-ronidy) i bílkovinné povahy [ly-1ické enzymy, proteiny indukované zvýšenou teplotou (heat-shock prateitts), proteiny indukované patogeny (pathogenesis-retated proteins), melalotioneiny]. Syntéza těchto látek je obvykle vyvolána patogenem nebo jiným inducíbilním faktorem. Lze očekávat, že jejich zvýšená aktivita by mohla vést i ke zvýšené širokospektrální indukované rezistenci rostlin. Enzym chalkonsyntáza kata lyžuj e klíčovou regulační reakci při syntéze rostlinných antibiotik - fyto-silťvinú (odd, 15.3.3). Byly proto zkonstruovány chimérické geny obsahující c hal konsyn lazový inducibil-ní promotor a strukturní gen kódující reportérovy enzym //-glukuronidázu (Doerner et al. 1990). Trans-gentií rostliny nesoucí tento chimérický gen jsou pak využívány k vyhledávání možných induktorů rezistence prostřednictvím snadné histochemické detekce /í-glukuronidázové aktivity. 16.4.6.4 Přenos genů navozujících rezistenci vůči herbicidům Pokud je /.námo cílové místo účinku herbicidu na rostlinný metabolizmus (obvykle se jedná o specifické vazebné místo v molekule některého enzymu), je v principu možné prostřednictvím genového inženýrství modifikovat toto místo tak, aby sc herbicid stal pro kulturní transgennť plodinu netoxickým. Prvního úspechu bylo dosaženo u herbicidu gíyfozátu. kierý blokuje funkci 5-enolpyruvylšikimál-3-loslálsyntázy (bPSP-symázy), klíčového enzymu biosynlézy aromatických sloučenin, což vede k .ailadověnf1 na aromatické aminokyseliny, k hromadění ši k i mátu a k smrti rostliny. Z bakterie Saimoneiia typhimurhtm byla izolována mulantní a Ida tohoto genu kódující riPSP-syn-lázu. která diky jediné aminokyselinové substituci prokazuje výrazné sníženou afinitu ke gíyfozátu, aniž by tím byla ovlivněna funkce enzymu. Tento gen byl nakloňován pod promotor cukaryotickcho typu a přenesen do rostlin, které pak vykazovaly vysokou toleranci ke gíyfozátu. Jiný herbicid, chlorsulfuron, se váže na enzym acetolaktátsyntázu, čímž blokuje bio-syntézu aminokyselin s rozvětvenou uhlíkovou kostrou. Mulantní a lei u tohoto genu, necitlivá k chlorsul-iuronu, která byla izolovaná z Arabidopsis thaliana, návodda rezistencí vůči herbicidu v transgenních rostlinách tabáku. Jako nej vhodnější se jeví využití strategií, kleté vedou k enzymatické deloxikaci herbicidu v rostlinách (Botterman a Leemans 19SS). Herbicid bialaphos je tripeptidové antibiotikum produkované Streptomycín hygrcnícopicHSt které po rozštěpení peptidázami uvol-ň ti i ľ ľdsfino'ľiciľi i analogon kyseliny l-ghiiamové). jenž je inhibitorem gluiaminsyntáz.y. Tento enzym má v rostlinách klíčovou roli v asimilaci amonných iontů a regulaci metabolizmu dusíku. Z mikroorganizmu 5. hygrvscopicus byl izolován gen, jehož produkt, fos-linotrieinacetyltninsferáza, katalyzuje noty lad toxického fosfinotricinu. Tento gen byl klon ován pod silným promotorem do ,,od zbrojeného'* Tf-plazmidu A. tumefaciens a navodil rezistenci transgenních rostlin tabáku, bramboru a rajčete vůči herbicidům biala-phosu a fosfinotricinu. 16.4.6.5 Regutovaná exprese chimérického metalotioneinu Genové inženýrství umožňuje řešit i problematiku některých toxických látek obsažených v rostlinné potrave. Patří sem zejména neesenctální těžké kovy (např. kadmium), které jsou přijímány rostlinami t půdy a mohou se akumulovat v částech rostlin, které představují lidskou a živočišnou potravu. U myší byl identifikován a klonován gen kódující protein metalotio-ncin, který má schopnost vázat (chclatizovatj těžké kovy. Příslušná myší c DNA byla klonována pod tran- 456 skripční kontrolu promotoru regulovaného švédem z menší podjcdnotky genu Rubisco a byly zkonstruovaný transgenní rostliny s metalotioneinovou aktivitou i vy&ĚÍ hladinou kadmia. Chelatizaeí kadmia je možné navodit vyšší odolnost rostlin vůči tomuto kovu a navíc vyvázal kudminm v těch částech rostlin, které nejsou součástí potravních řetězců človeka. 16.4.6.6 Produkce farmakologicky významných látek Transgenní rostliny mají strategický význam i pro masovou výrobu ncjrůzflčjSích hiofarrňak- Tyto látky, ze-jména biologicky aktivní peptidyt mohou být produkovány jako Část chimérických rostlinných zásobních proteinů. Například část genu kódujícího albumin 2S u Artibitiopsi-n thatiana byla nahrazena sekvencí kódující ne u rope pt i d leu-enketatin se sousedním místem pro štepení peptidázou. Pomocí vektorového systému A. mniťfut■fťťt.v byl tento konstrukt vnesen do rostlin A, ihaliana a albuminy 25 izolované ze semen byly tráveny trypsinem a izolován leu-enkefalin (Vande-kerckhove ei al. 1989), Touto relativnč jednoduchou cestou je tedy moí.né dosáhnout masové produkce farmakologicky důležitých látek ze semen transgenních rostlin. 16.5 Souhrn V průbčhn posledních dvou desetiletí bylo dosaženo velkého pokroku v oblasti molekulami a bunččné genetiky rostlin. Stalo se lak díky objevu možnosti vnášeni klonovariýeh genů do rostlin pomoci bíiktcric Ag-robactcriífm tumefacieris a zejména pak díky využití nejmodernejíích technik molekulární genetiky. Rostliny jsou eukaryotickými organizmy s tripartitním ge-nomem (jádro, mitochendrie a plastidy). Jejich genetická informace je kódována sekvencemi nukleotidů v DNA. Vzhledem k tomu, že genetický kód je u rostlin a organizmů z jiných skupin eukaryot i prokaryot totožný, je možné rostlinný genom modifikovat přenosem cizorodých genů s vhodnými regulačními sekvencemi, S pomocí agrobaklcriálních vektorů již bylo připraveno mnoho transformovaných (transgen-ních) rosil in. které se uplatnily jak v základním výzkumu (studium struktury a funkce genů), lak i v zemědělské praxi. Struktura i počet genů v rostl i on é m jaderném genom u jsou v zásade podobné jako u ji- ných cukaryotických organizmů. Jednotlivé druhy vyšších rostlin se často vyznačují velmi odlišnou velikostí jaderného genomu, přičemž lato velikost není v korelaci s komplexitou příslušných rostlinných organizmů. Včlí i na druhů rostlin má vysoký obsah DNA v bunečných jádiech (az 10" párů bází), což souvisí se značně velkou frakcí opakujících se, obvykle inak-tivních a metylováných sekvencí DNA. Procesy diferenciace rostlin jsou řízeny kombinatorickým účinkem mnoha genů, které jsou exprimovány (v závislosti na vnéjíím prostřed0 přísné místné a časoví. Podobné jako u jiných eukaryot byly i u rostlin identifikovány lzvr homeolické geny. které kódují transkripciu' faktory aktivující geny zodpovědné fit procesy tnorfogeneze. Současné výzkumy ukazují. Že také mechanizmy ep i genetické dedičnosti odpovědné za milotický přenos informace o aktivite genů (zejména metylace DNA, kinetiká replikace DNA a ace-tylace nukleozomálních histonů)jsou u rostlin obdobné, jako je tomu u ostatních eu kary etických organizmů, Vzhledem k neschopnosti lokomočního pohybu došlo u rostlin v průběhu evoluce k vytvoření mnoha mechanizmů, které zvyšují jejich schopnost adaptace vůči mčnícím sc životním podmínkám. Patří k nim i totipotence, tj. schopnost každé (somatické i gene rat i v ní) buňky dát vznik celému rostlinnému organizmu. Tato schopnost představuje velkou výhodu pro využití rostlin jako experimentálních eu kary etických modelů. POUŽITA LITERATURA Aranson A. !„Bíckmnn W., Dunn P.(19Í6); Microtnol. Rev. 50: ]. Bcnnct M. D.. Smilh J. B. {1476): Philos. Trans. R. Soc. London, B 274: 227. Rlackbum E. H. (IWI); Trends Biochcm. Sei. 16; m. HoUennm J., I jcmuns J. ( 19$$): Trends Gcmct. 4; 219. HrišiDti N.. Pimkowskl J.. Pŕmwkk J. R., GKKíenborn B., Pntrykus ľ, Hohn T (19M) Náture 310: 511. Burn J E . BmjnjH D. J.. Metzger L D., Dennis E. S., Rncodf Vť J. (1993): Phx NalJ. Aľíií. Sei USA 90: 2S7. Doerner P. W., Slcrmcr B.r Schmid J., Diiwi R. A.. Lamb C. J- {I9<í0;: Bio/Technology S; «45. Dörinjj H.-P..Slarlingcr P, C]S»Bů>r Annu. Rcv.Gtncl. 20: 175. HMniL-h J. J., PrinKeii F.. vjn OnĽ kelen U., Sthiell J., SjKn.i A (1991): Science 254: 1364 Finnegan E. J.r Pcacock W. J.. Dennis E. S. ()99ťi>: Prút. Nml. Acad. Sei. USA 93: S449. Ftavell R. B. (1980): Ann u. R«v. Píam Phytiol. 31: 569. Ravdt R. B. 11*86); Otfori Surv. Plam Mol. Bioí. S: 251. French R , Jandu M., Ahlquisi P. (I9flft): Sdence 231: 1294. Gali ie D. R. 11993): Aíinu. Rev. Plant Pliysiol. Planí Mol. Bial. 44: 77. 4>7 Gin S , Amasimi R. M. < I995): Science 270: I9K6 GoíxI X.. Kclldjíi; J. A., Wuguner W., Langjtoff D., MitSlflUO W.. Best wick R K (1994): Plant MdL Biol. 26: 781. Grandbaslicn M.-A. (1992): Trends Gcnci. 8: 103. Grant S.. HouE>cfl A . Vyškol R., Simky J.. WeiUua P.. Miica-i J . Saedlet IT. (1994): Dev. Genet 15: 214. Grant S. G.r Chapman V. M. < I9BB): Annu. Rev. Genet. 21: 199. Hü A., Caffefkcy R.. Boyish K. (1989): Nature 342: 76. Holiday R. (1990): Philus Trans R Soc. London. B 326: 329 iuKwlefc H, Šimky J., VysJwí 0.(19*0: Mol. Oat, Genei 150:433. Jiynes J. M , Yang M. S_, Espinou IV-, Dodds J H (198Ů): Trendu Biolechnol. 4: 314. KubkIc J. L„ Allcman M. {1990): Development [SuppU, 9. Kuroiwa T. (1982): Int. Rev. Cytol. 75: I. IjndsťhuL/e V.. Wilmil7er 1... Müller Roher li. (1995): EM HO J 14: 660. Leu in F, (19*3); Science 219: 47B. Lock L F., Takagi N . Martin C. R. {1487): Cell 4«: 3ft Lyndon R. F.. Franci!; D. (19921: Plant Mol Bin) 19; 51 Mandel M. A., Bowman J. L., Kcmpin S. A.h Ma H.. Mcycrowitz E. M„ Yanofcky M. F (1992): Cell 71: 133. M.i/ .ini ('. IV Bcuckclccr M.. Tmcltncr J„ Lccmans J.. Guldberjj RR. (1990): Nature 347: 73 7. Msizke M. A.. Miteke A. J. M. (1995): Plant Physiol ]07; 679. MjyiunJ Smith J. (1990): J. TlleOr. Biol. 143:41. Mcins F.. Jr. (1994): In: Mok D. W. S.. Mok M. C. (edi): Cytokines. Chemistry. Activity, and Function. CRC Press,. BocaRaton. 269. Mtlllcr-Rober B.. Scmncwald U., Willmirar L (1992): EMBO J. 11: 1229 Nagl W. (1990); In: Bajaj Y. P. S. (ed.): Somatloníil Variation in Crop ImúruvemellI. Vol. I. Springer-Verlag, Berlin, t53. NcgruLiu I.. Cpharti-Chlielri G. B. (cds) ( 1991): A Laboratory Guide for Cellular and Molecular Plant Biology. Birkliauscr Verlag. Basel. Penarrubia L., Kim R., Giovannom J., Kim S.-H., Fischer R. L. CIW2); Biortccnnolo|y 10: 56 L Potrykus I. (1990): Physiol Plant 79: 125. Sambrocdí J., Fnlsch E. F.. ManiitiaT (L9S9): Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Ed. 2. Cold Spring Harbor Lab Fr«s. Mew York. 5.:hwiirv.-SomrtieT Z., Hui.ijier P., NackC-rt W., Saedlcr H., Sommer H (1990): Science 250:931, Npcna A,, Prinsen b,. ťladung M.. Schulze S, C. van Onckelcn H. (1991): Myl Cen. Genet. 227: 205 Stark DM., Timincrman K. P., Barry G. F.. Preiss J., K i share G. M. < 1992): Science 258: 287. Tinland B. (19%): Trends Planl Sci. 1: 178 Topfer R . Martini N., Schel! J (1995): Science 2ÍS: 681. Vandckcrcknove J., van Damme J., van Lijscbcllcns M., Botlcrman J., Dc Block M„ Vandewiele M., De Ocroq A., Lrcmun\ J., van Miintaju M_. Krehrm E. (19B9): Bio/Tethnolugy 7: 929. Vyskdl B.. Arayii A.. Vcuiktni L, Nejjruliu I , Moitras A. Í1993): Mol. Gen. Genet 239: 219. VyxJcnl B.. Krsultal