Histologické a (imuno)histochemické metody vhistologie je nauka o mikroskopické skladbě organismu vzkoumá skladbu těla živočišného i rostlinného, důležitá v humánní medicíně vhistologický preparát zhotovený různými histologickými technikami vtenké řezy vmikrotom vbarvení vnejběžnější formou histologického preparátu je tenký řez určitým organismem, orgánem, tkání, obarvený některou z metod histologické techniky a uložený mezi podložním a krycím sklíčkem •Rozdělení v v Cytologie – nauka o skladbě buňky v Histologie – v užším slova smyslu, nauka o skladbě tkání v Mikroskopická anatomie – nauka o mikroskopické skladbě orgánů Cytologický preparát Mattesia dispora Leidyana ephestiae Hepatozoon sp. Trypanosoma equiperdum Histologický preparát Cryptosporidium fragile v žaludku ropuchy žaludek ropuchy Zpracování tkání - histologie Ø ØOdběr Ø ØFixace Ø ØKrájení ütkáně prosycené parafínem nebo pryskyřicí üzmrzlé tkáně Ø ØBarvení Odběr vBiopsie ü Punkce ü Excize ü Kyretáž ü Peroperační biopsie v vNekropsie v vPostup: ü Oddělení vzorku - velikost tkáňového bločku max. 1cm2 ü Opláchnutí ve fyziologickém roztoku ü Vložení do fixační tekutiny - ihned po odběru !!! ü Označení vzorku Fixace v rychlá a šetrná denaturace bílkovin bránící autolýze • tkání v podmínky fixace ü rychlost - odběr, průnik, velikost vzorku (1cm2, 1mm2) ü zachování struktury ü barvitelnost v fixace fyzikální v fixace chemická Fixační tekutiny v formaldehyd (4% formaldehyd, neutrální nebo pufrovaný) v Bouinova (formaldehyd + k. pikrová) v Zenkerova (dvojchroman draselný, sublimát, formaldehyd) v metacarn (formaldehyd, metanol, voda) v Davidson (glycerol,formaldehyd,etanol, voda) v AFA (ethanol, formaldehyd, kyselina octová ledová) v oxid osmičelý, glutaraldehyd Parafínové řezy ü Odvodnění - vzestupná etanolová řada ü Projasnění - xylen ü Prosycení parafínem ü Zalití do parafínu ü Krájení na mikrotomu (tloušťka řezu 4-10μm) Ø Rotační x sáňkový mikrotom ü Napínání a lepení řezů na podložní skla Prosycení parafinem 001 Výhody a nevýhody parafinových řezů * Poměrně tenké řezy, které lze barvit téměř všemi metodami * Uchovávání nakrájených řezů na sklíčku a zbytku zalité tkáně v parafinovém bloku neomezenou dobu * možnost kdykoliv nakrájet další řezy a doplnit barvení * * Alkoholová řada i zalití do parafinu ničí enzymy a způsobuje vyluhování tuků * Odvodňováním může dojít ke smrštění tkáně a vzniku artefaktů * Rotační mikrotom Barvení parafínových řezů HE üOdparafinování – xylen I, xylen II, 100% alk., 96% alk., 70% alk., voda üBarvení hematoxylinem üPraní v tekoucí vodě do zfialovění üBarvení eosinem üOplach ve vodě –odstranění přebytečného barviva üOdvodnění vzestupnou alkoholovou řadou üProjasnění üMontování do kanadského balzámu nebo Damary Ø Obrázek1c Image9 Hematoxylin-eosin svalovina larvy Galleria melonella senzila larvy Galleria melonella Při barvení HE jsou jádra buněk modrá hematoxylinem a cytoplasma růžová eozinem Massonův trichrom Modrý Kolagenní vlákna ve tkáni modrá tegument a svalovina larvy G. melonella tegument larvy G. melonella Obrázek9 Obrázek3y Massonův trichrom Zelený Kolagenní vlákna zelená Elastická vlákna fialová senzyla larvy G. melonella svalovina larvy G. melonella Ggarnhami Hematoxylin jádra modrá -Bestův karmin glykogen purpurově červený Gregarina garnhami v caecu sarančete Polotenké řezy * Zalévání do pryskyřice (Spurr – podle autora) * Fixace glutaraldehydem nebo osmiem * Odvodnění alkoholová řada + aceton * Pryskyřice polymeruje při 60°C * Krájení na tzv. polotenké řezy (500nm – 2 µm) * Barvení - toluidinová modř * Nepřikrývají se krycím sklem * Po kontrole na světelném mikroskopu se ze vzorku vybere místo, které je zajímavé a ze kterého se budou krájet ultratenké řezy pro transmisní elektronovou mikroskopii en2 Řez hlavou Eudiplozoon nipponicum Krájení zmrazených tkání v Zmrazovací mikrotom, kryostat v v Použití: ü Imunohistochemie ü Barvení tuků ü Průkaz enzymů ü Peroperační biopsie Výhody a nevýhody zmrazených řezů * Rychlé zhotovení * Uchování enzymů a tuků pro jejich průkaz (histochemie) * * * Řezy jsou hodně silné * Nelze uchovávat nezpracované tkáně k dalšímu dokrájení Průkaz melaninu (pigment ve vnější kostře hmyzu) (Lillie’s ferric-ferricyanide melanin staining method with or without acetocarmine counterstain) larva G. melonella parazitovaná kuklicí Značení a fluorescenční mikroskopie Gregarina polymorpha Mattesia dispora