1 Fluorescence a Konfokální mikroskopie Bi4170 Optické kontrastní a zobrazovací metody Podzim 2014 Šárka Mašová Fluorescenční mikroskopie •Excitace a pozorovní fluorescenčních molekul • •Velmi často používaná: vysoké rozlišení, citlivost, nízké pozaní, více kanálů… • •Mnoho různých variací • dekonvoluce, OMX (Structured Illumination Microscopy), deltavision • konfokál, spining disk, 2 foton • TIRF, FRAP, FRET, FLIM, iFRAP, FCS … • PALM, STED, STORM, SIM, (super-resolution) • •Stále ve vývoji • 2 K čemu je fluprescence dobrá? •Např.: •Určení lokalizace specifických proteinů •Určení tvaru orgánů, buněk, intracelulárních struktur •Zkoumání dynamiky proteinů •Studium interakce proteinů a proteinových konformací •Zkoumání iontových koncentrací atd. 3 Princip fluorescence •Fluorescence - fotoluminiscenční záření •vyvolána: •účinkem jiného dopadajícího záření (absorbcí) •účinkem dopadajících částic •= sekundární záření, které je charakterizováno vyzářením energie ve velmi krátké době (řádově 10-9 s až 10-6 s) •emitované záření je vyzářeno atomem, který energii pohltil •přechod z prvního singletového stavu (S₁) do singletové hladiny (S₀) • 4 Fluorescence •Jablonského diagram •Aleksander Jabłoński (PL) 5 Excitovaný stav Základní stav excitace Kratší vlnová délka Vyšší energie emise Delší vlnová délka, méně energie à Stokesův posuv A jablonski.jpg Fluorescenční techniky •Standartní techniky: wide-field • konfokál • 2-photon • •Special techniky : FRET • FLIM • FRAP • Fotoactivace • TIRF • 6 Rozlišení • 7 8 Konfokální mikroskop •confocal laser scanning microscope (CLSM) •Confocal - conjugate (sbíhat) + focal (ohniskový) • Konfokální mikroskop je druhem optického (fluorescenčního) mikroskopu, jehož výhodou je vyšší rozlišovací schopnost daná detekcí světla pouze z ohniskové roviny mikroskopu. Termín "konfokální" znamená "mít stejné ohnisko/zaostření ". Toho je dosaženo tak, že se zaostří kondenzorové čočky do stejné ohniskové roviny jako čočky objektivu. 9 Konfokální mikroskop •Na detektor dopadá pouze obraz řezu objektu v rovině fokusace (modrá) •Odstranění „nezaostřené“ (blurred) části obrazu •a) opticky (pinhole) •b) výpočtem – dekonvoluce kondenzerová čočka Pinhole 1 Pinhole 2 objektivová čočka vzorek Podle: Handbook of Biological Confocal Microscopy. J.B.Pawley, Plennum Press, 1989 detektor zaostřená rovina optický řez •mšice 10 Aphid Fluorescenční mikroskop Objektiv Oblouková lampa Emisní (bariériový) filtr Excitační diafragma/clona Okulár Excitační filtr Konfokální princip Objektiv Laser Emisní Pinhole Excitační pinhole PMT (photo multiplier tube) Emisní filtr Excitační filtr dělič paprsků a rastrovací zařízení 13 Fluorescenční mikroskop objektiv Oblouková lampa Emisní filtr Excitační diafragma okulár Excitační filtr objektiv Laser Emisní pinhole Excitační pinhole PMT Emisní filtr Excitační filtr Konfokální mikroskop Výhody konfokální mikroskopie •Redukované rozostření obrazu způsobené rozptylem světla •Zvýšené efektivní rozlišení •Lepší poměr signálu ku šumu •Jasné / „čisté“ pozorování tlustých vzorků •Možnost skenování v ose Z •Vnímání hloubky obrazu a prostorového uspořádání v řezech v ose Z 15 zaostřená rovina zrcadlová bodová clonka laser dělič paprsků a rastrovací zařízení informace o souřadnicích bodů (X - Y) konfokální bodová clonka detektor světla informace o intenzitě světla objektiv objekt Schéma současného konfokálního mikroskopu (s rozmítaným laserovým paprskem) (Vesmír, 1995) •Bodový zdroj světla: laserový paprsek fokusovaný na clonu •Clona je objektivem zobrazena do bodu (průměr = rozlišovací schopnosti objektivu) •Objektiv sbírá světlo odražené a rozptýlené – zpětný průchod objektivem: obraz bodové clonky •Druhá konfokální bodová clonka (blokuje nezaostřené roviny) •Fotonásobič a detektor světla • 16 • Bodové skenování 17 x y Laser - vstup Laser - výstup k mikroskopu 18 a mikroskop IX 81 b konfokální nástavec c lasery d řídící jednotky a b c d Olympus Fluoview 500 konfokal3 Info: http://www.olympusfluoview.com/products/fv500/index.html 19 Olympus Fluoview 500 • optické řezy v rovinách XY, XZ, XYZ , XZY • schopnost zaznamenat změny i v časové rovině XYt, XYZt •současné snímání obrazu v procházejícím a fluorescenčním světle • použití 4 kanálů zároveň • sekvenční snímání • volitelnost rychlosti a typu rastrování => kvalita snímku • kompenzace šumu, zesíleni signálu • 3D rekonstrukce obrazu a rotace - Imaris • Skenování – str. 7, 3D imaging str. 8: http://www.olympusfluoview.com/brochures/pdfs/fluoview.pdf 20 Olympus Fluoview 500 Stavba – str. 4: http://www.olympusfluoview.com/brochures/pdfs/fluoview.pdf 21 Rastrování cslm5 www.bioteach.ubc.ca typy mikroskopu: • rastrující konfokální mikroskop - skenující zařízení zařizuje posun ohniska excitujícího laserového paprsku • konfokální mikroskop s rotujícím diskem - místo skenujícího zařízení obsahuje rotující Nipkowovův kotouč, na kterém je mnoho navzájem oddělených clonek • netvoří obraz vcelku, ale bod po bodu, řádkováním • pomocí řádkování jsou snímány optické body v rovině XY i jednotlivé optické řezy v ose Z díky definovanému posuvu objektivu • konfokální obrazy jsou zaostřené a představují jednotlivé optické řezy vzorkem • složení trojrozměrných obrazů vychází z možnosti postupného snímání desítek až stovek optických řezů v ose Z 22 Historie •Marvin Minský •1957 – patent •neměl vhodný zdroj světla • http://www.currentprotocols.com/protocol/cy0208 http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Primeira_P%C3%A1gina_da_Patente_de_Marvin_Minsky_Sobre_o_Micr osc%C3%B3pio_Confocal.gif Důležitý doplněk: Nipkowův kotouč desítky až stovky tisíc otvorů (200 tis) v Archimedových spirálách kotouč rotuje (desítky Hz) otvory konjugované (v dopadajícím a detekovaném světle-viz. Petráň) Základem je tzv. Nipkowův kotouč, na kterém je systém velmi malých otvorů. Tyto otvory jsou osvětlovány intenzívním světlem, promítnuty objektivem na vzorek, světlo z nich odražené je objektivem opět fokusováno na konjugované otvory v Nipkowově kotouči a obraz vytvořený světlem těmito otvory prošlým je pozorován standardním okulárem. Rastr pokrývající celý obraz je vytvořen rotací kotouče (obr. 4). Celé zařízení je velmi náročné na přesnost a k zobrazení se využívá jen asi 1 % světla. 23 Historie •Petráň M. a Hadravský M. (1967) - konstrukce konfokálního mikroskopu pracujícího na bázi rotace Nipkowova kotouče (Tandem Scanning Confocal Microscope) • rozvoj od konce 70. let 20. století - rozmítaný laserový paprsek, počítač • dvou (multi-) fotonový mikroskop • http://www.currentprotocols.com/protocol/cy0208 Doporučuji dokument čt: Prof. Petráň (cca 18 min): http://www.ceskatelevize.cz/program/10209988352-07.05.2009-22:45-2-zaslapane-projekty.html?backaddr =search&tipy=1&online=1 Důležitý doplněk: Nipkowův kotouč desítky až stovky tisíc otvorů (200 tis) v Archimedových spirálách kotouč rotuje (desítky Hz) otvory konjugované (v dopadajícím a detekovaném světle-viz. Petráň) Základem je tzv. Nipkowův kotouč, na kterém je systém velmi malých otvorů. Tyto otvory jsou osvětlovány intenzívním světlem, promítnuty objektivem na vzorek, světlo z nich odražené je objektivem opět fokusováno na konjugované otvory v Nipkowově kotouči a obraz vytvořený světlem těmito otvory prošlým je pozorován standardním okulárem. Rastr pokrývající celý obraz je vytvořen rotací kotouče (obr. 4). Celé zařízení je velmi náročné na přesnost a k zobrazení se využívá jen asi 1 % světla. 24 Klasická mik. •Předpoklad malé tloušťky preparátu •Silné vzorky – překrývání obrazu zaostřené roviny nezaostřenými (nad i pod) •Vzorky o tloušťce menší než je hloubka ostrosti objektivu (závisí na numerické apertuře) • obrazem ne bod, ale Airyho kroužky Konfok. Mik. •Potlačení mlhavého pozadí obrazu •Optická tomografie •Obraz vzniká skládáním z jednotlivých bodů, které jsou pozorovány přes clonky, jejíž rozměry bývají menší než Airyho kroužky • • 25 myší mozek hippocampus myší hladká svovina pylové zrno, slunečnice Poznámka: významné množství fluorescenčního signálu obrazu v širokém poli se nachází mimo ohniskové roviny. 26 Výhody CLSM •odstranění mimoohniskových rovin •vysoký kontrast obrazu •neinvazní metoda •zachování prostorového uspořádání •schopnost vytvoření prostorové rekonstrukce •digitální forma výstupu - rotace, perspektiva, ... •schopnost zobrazení buňky - tkáně - mnohobuněčného organismu •současné použití až 4 kanálů + procházející světlo 27 Nevýhody CLSM • délka zpracování materiálu i snímků →,,vyhasínání fluorescence” (photobleaching) • neostré snímky při nízké intenzitě fluorescence • pořizovací cena (mikroskop, konfokální nástavec, počítač + program) fluorointrofigure4 28 http://abrc.sinica.edu.tw/icm/app_out/main/jpg/theorem04.jpg ProLong® Gold antifade reagent •Prolong Gold •Vectashield •DABCO www.invitrogen.com • duke lmcf orthogonal slices of 3D image stack http://microscopy.duke.edu/3D/ 30 31 sp9 sp2 sp3 sp4 sp5 sp7 sp8 • Gallery_MIP mIP_rotation http://microscopy.duke.edu/3D/ 33 Imaris •software (Bitplane) •vizualizace •segmentace a interpretace 3D a 4D dat • http://www.imaris.com/go/products/imarisbatch surface_render SurfRend200 Další programy: Leica LAS software, ImageJ, MetaMorph and Huygens http://microscopy.duke.edu/3D/ Metaphase : LSM510 3D module (Zeiss) Metaphase-Tobacco.gif Neurocapsule.gif Telophase.gif tobacco-leaf.gif Metaphase Imaris software Bitplane neurokapsule Imaris software Bitplane Tabák. b. v telofázi Imaris software Bitplane Cytoskelet a chloroplasty tabáku LSM510 3D module (Zeiss) http://www.crp-sante.lu/en/Competence-centers/Luxembourg-Biomedical-Research-Resources/Confocal-Mic roscopy/Activities/3D-reconstructions-and-animations 35 • reflexe - textura a složení povrchů - elektronických součástek, studium neuronových sítí (pomocí Ag), … • • • • • procházející světlo • fluorescence - struktura buňky a tkání, studium metabolických drah, ... • Využití světla pro CLSM confocal reflection image of chip 36 37 HlavaX20c vazba aktin-faloidin (FITC) adult 38 adhlavapri10b adhltanup180up vazba aktin-faloidin (FITC) 39 Hlava40X20 vazba aktin-faloidin (TRITC) 40 sada1 svorka2-upr fluorescence Gomoriho trichromu hom2 41 tubulin b vazba tubulin-protilátka (FITC) 42 aktin+dna aktin+dnafibroblast Convolutriloba longifissura vazba aktin-faloidin (FITC) vazba DNA-DAPI 43 mikrotubuli proteiny neuronu fal+mitrotrachcer red+dapi vazba aktin-faloidin (FITC) vazba DNA-DAPI vazba mitochondrie-mitotracker red neuron, vazba mikrotubulové proteiny- protilátka (Texas-RED) 44 Live2-2-2005_10-48-23_AM autofluorescence 45 Muller, Worsaae (2006) Phalloidin, F-actin: Annelida; body wall musculature 46 NERVOVÝ SYSTÉM - BONELLIA VIRIDIS (ECHIURA) Anti-tyrosinatedtubulin immunoreactivity, ventral view, depth-coding Hessling, Westheide (2002) 47 In vivo labeling of different embryonic territories with three spectrally distinct fluorescent proteins Rhee et al. 2005 48 glutaraldehyde-introduced fluorescence for the microscopic analysis of plant biotrophic interactions FESTER et al. 2008 49 (Lacey, 1999) Srovnání 3 metod užívaných ve fluorescenční mikroskopii fluorescenční konfokální 2-fotonová laser laser rtuťová výbojka optický řez (0,5-2µm) excitační světlo pozorovaná oblast oblast excitace ( „vyhasínání“) jednofotonové konfokální mikroskopy nemají možnost UV excitace, proto až nyní bude možné získávat konfokální obrazy při užití fluorochromů s UV excitací. Dvoufotonový mikroskop představuje nový typ konfokálního mikroskopu (Denk et al., 1990, Diaspro, 2002). Od „klasického“ laserového konfokálního mikroskopu se odlišuje tím, že místo jednofotonové excitace využívá excitace dvěma fotony, které jsou absorbovány prakticky současně, tedy v jediném kvantovém okamžiku. Toto je možné zabezpečit pouze pomocí speciálního laseru, který vysílá fotony s šířkou pulsu řádově 100 femtosekund. Energie fotonů se sčítají, a proto je při dvoufotonové excitaci vlnová délka vysílaného záření zhruba dvojnásobná než u jednofotonové excitace.Pravděpodobnost dvoufotonové excitace je úměrná druhé mocnině intenzity excitačního pole, která je nejvyšší v ohnisku objektivu. K excitaci tak dochází pouze v rovině zaostření, a proto k získání obrazů optických řezů vzorkem nepotřebujeme odstiňovat obraz z nezaostřených míst pomocí konfokální clonky, jako je tomu u „klasického“ jednofotonového konfokálního mikroskopu. Vzorek je tak ozařován pouze bodově a zhášení fluorochromů v nezaostřených místech vzorku je výrazně omezeno. Mezi hlavní výhody dvoufotonové mikroskopie ve srovnání s klasickou konfokální mikroskopií patří: - výrazně menší zhášení fluorochromů v celé tloušťce vzorku - větší hloubka proostření (až do 400μm) i u vzorků, jejichž povrchové vrstvy vykazují silnou fluorescenci - zvýšený podíl signálu k šumu (signal/noise ratio), tedy kontrastnější obrazy, zejména ve větších hloubkách vzorku - snížená fototoxicita, umožňující krátko- i dlouhodobé pozorování živých buněk a tkání i při použití fluorochromů s UV excitací - excitace laditelná v rozmezí od UV do modrozelené oblasti (700-1000 nm) bez speciální optiky nutné při excitaci UV lasery - lepší možnosti detekce jednotlivých molekul, např. metodou FRET (fluorescence resonance energy transfer) Dvoufotonová mikroskopie má široké využití v mnoha biologických oborech. Umožňuje získávat tenké optické řezy buňkami či tkáněmi a zobrazit jejich různé komponenty s využitím vícenásobného barvení. Při fyziologických studiích bývají často využívány časové série, zaznamenávající časové změny např. v koncentraci různých iontů v různých oblastech studovaného vzorku. Digitální obrazy sérií optických řezů představují data vhodná pro kvantitativní měření i pro počítačové trojrozměrné rekonstrukce relativně velkých oblastí vzorku, aniž by bylo nutné řešit problém lícování následných fyzických sériových řezů (Pawley, 1995). V přednášce budou diskutována některá úskalí, kterým je třeba čelit při praktickém používání dvoufotonové excitace, např. jaké barvení je vhodné či jak zabránit přehřátí vzorku, ke kterému může dojít z různých příčin, jako je příliš velká intenzita budícího laserového záření či absorpce infračerveného záření některou složkou vzorku. (http://wwwueb.asuch.cas.cz/methods/files/Methods_2003/abstrakta_2003.pdf) 50 • absorbce 2 fotonů fluorochromem ve stejném okamžiku => záření s dvojnásobnou vlnovou délkou (poloviční energie) => excitační záření 700 nm (červená) => emitované záření 900 nm twoph_pollen_sm confocal_pollen_sm Dvoufotonová mikroskopie http://biomicroscopy.bu.edu/r_nonlinear.htm 51 Výhody • se zvyšující se intenzitou záření zdroje se zvyšuje pravděpodobnost absorpce 2 fotonů fluorochromem • excitace fluorochromu jen v zaostřené rovině => odpadá nutnost konfokální clonky => maximum světla • velká vlnová délka (700 nm) => pomalejší „vyhasínání“ menší rozptyl světla ve vzorku větší penetrace světla ve vzorku malá fototoxicita (x UV záření) Nevýhody • cena Ti:Sapphire laseru • ohřev vzorku => užití laserových pulsů než plynulé ozáření Základní omezení konfokální mikroskopie ze zdroje k detektoru . x,y,z 2 n2 fotony 2 1 n1 fotony 1 z y x VOXEL PIXEL Zdroj: Handbook of Biological Confocal Microscopy. J.B.Pawley, Plennum Press, 1989 (volumetric – objemový + pixel) - částice objemu, představující hodnotu v pravidelné mřížce třídimenzionálního prostoru počítačové grafiky - analogie k pixelu, který reprezentuje 2D grafiku - voxely se používají nejčastěji při vizualizaci a analýze lékařských a vědeckých dat - picture element, obrazový prvek - někdy též pel, dále zkracováno na px - nejmenší jednotka digitální rastrové grafiky - jeden bod obrázku zadaný svou barvou 53 konvoluce •zkreslení díky nedokonalosti optických zařízeni •bodová rozptylová funkce •= PSF - Point Spread Function - důvod „rozmazání“ obrazu • dekonvoluce deconvolution_icon matematické zpracování obrazu, které redukuje rozmazání obrazu a vylepšuje kontrast a rozlišení Deconvolution is a mathematical processing of images to reduce the blur from out of focus light. It brings improvements in both contrast and resolution and can be used for both 2D and 3D datasets. Kvalitu snimků lze vylepšit pomoci počitačove dekonvoluce. Obraz pozorovaneho objektu v mikroskopu neni idealni, ale podleha optickemu zkresleni diky nedokonalosti optickych zařizeni. Hovořime o tzv. konvoluci signalu. Idealni opticka draha paprsku skrze opticke zařizeni je konvolvovana matematickou přistrojovou funkci popisujici zkresleni zařizeni (tzv. bodova rozptylova funkce, PSF). Pokud je možne tuto funkci identifikovat (v praxi se použiva různych aproximaci nebo experimentalně naměřena přistrojova funkce), lze pomoci softwaroveho dekonvolučniho algoritmu ziskat nezkresleny obraz (Swedlow a Platani, 2002). ZDROJ: https://is.muni.cz/auth/th/63720/prif_m/diplomova_prace.pdf ------------------------------ V oblasti zpracova´nı´ digita´ lnı´ho obrazu je konvoluce jednou z nejcˇasteˇji pouzˇ ı´vany´ch operacı´. Tato operace ulozˇ ı´do vy´ stupnı´ho obrazu linea´ rnı´ kombinaci intenzit ze vstupnı´ho obrazu. bod ve vy´ stupnı´mobraze je va´zˇeny´msoucˇtembodu° ze vstup- nı´ho obrazu. To jake´ majı´ jednotlive´ body va´hy je da´no konvolucˇnı´m ja´drem rozptylova´ funkce popisuje rozmazanı obrazu. (zdroj: https://is.muni.cz/auth/th/50771/fi_r/rigorous.pdf) Světlo dopadající na detektor, vzniklé v jednom (imaginárním) bodě snímaného obrazu lze popsat funkcí, která se nazývá PSF (Point Spread Function). Tato funkce má při získávání obrazu velký význam. PSF určuje, jak bude vypadat každý zobrazený bod vzorku. Uvažujeme-li, že vzorek je složen z jednotlivých bodů, pak v získaném obraze je místo každého takového bodu funkce PSF s intenzitou příslušného bodu vzorku, tato operace je nazývaná konvoluce (bude popsána později). Čím je obraz PSF větší, tím více bude nasnímaný obraz rozmazaný; velká PSF tak přispívá ke snížení rozlišení obrazů. PSF konvenčních mikroskopů je v porovnání s konfokálními poměrně velká. (zdroj: http://is.muni.cz/th/50721/fi_m/diplomka.pdf) 54 http://www.3d-doctor.com/hubble.jpg 55 • AutoDeblur® AutoQuant® http://spectraservices.com/DEBLUR.html 56 Informační zdroje •http://www.olympusconfocal.com/theory/LSCMIntro.pdf •http://www.fmhs.auckland.ac.nz/sms/biru/gallery/clsm-images.aspx •http://www.bcm.edu/cain_foundation/noframes/html/pages/staff/robert_mcneil.htm •Clypeaster subdepressus larva: http://mestrado.organelas.com/en/category/confocal/ •http://www.confocal-microscopy.org/ •http://measure.feld.cvut.cz/groups/edu/sz2/prednasky/2sadaPrednasky/Princip_konfokalni_mikroskopie .pdf •http://www.physics.emory.edu/~weeks/lab/papers/ebbe05.pdf •http://www.olympusfluoview.com/theory/LSCMIntro.pdf •http://apfyz.upol.cz/ucebnice/down/optmikro.pdf •Fluorofory: http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/soubory/fluorofory.htm 57 Literatura •