Úkoly List BCA-Cviceni (datum vaší skupiny) 1) Vypočítat rovnici kalibrační přímky ředění standardu BSA 2) Vypočítat koncentrace stanovovaných vzorků 3) Vypočítat objem vzorku nutný pro nanesení 15 ug proteinů na gel List MAPK-Western blot & přiložené *.tif soubory 4) Provést denzitometrickou analýzu výsledků Western blotu MAPK pERK1/2 (fosfo-ERK1) a MAPK ERK1/2 (celkový ERK) " - k analýze použít přiložené soubory ""phosphoERK.tif"" a ""totalERK.tif""" - anotace obrázků a postup analýzy pomocí ImageJ viz list MAPK-Western blot - do tabulky dosadit výsledky z ImageJ => vypočítat relativní denzitu a normalizovanou denzitu "Poznámka: Excelové buňky se zeleným stínováním jsou ty, které je potřeba vyplnit" Otázky & Odpovědi Jméno Datum cvičení Číslo vzorku 1) Směrnice kalibrační přímky BSA? 2) Intercept kalibrační přímky BSA? 3) Koncentrace proteinů v neředěném vzorku mg/mL směrodatná odchylka: koeficient variance: 4) Objem vzorku obsahující 15 ug proteinu? uL 5) Kolikrát se u buněk ošetřených TPA zvýšil podíl fosforylované varianty MAPK ERK1 oproti kontrole (při normalizaci na celkové množství MAPK ERK1 ve vzorku)? 6) Kolikrát se u buněk ošetřených TPA zvýšil podíl fosforylované varianty MAPK ERK2 oproti kontrole (při normalizaci na celkové množství MAPK ERK2 ve vzorku)? 7) Jaká konkrétní fosfomísta MAPK ERK1/2 byla v tomto experimentu hodnocena (typ aminokyselinového zbytku a jeho pořadí v peptidovém řetězci)? ERK1: ERK2: ##### Sheet/List 2 ##### Popis desky Plate Title Standard BSA (uvedny jsou koncentrace zásobních roztoků - není zohledněno ředění 3/4 před testem!) Vzorky Vzorky 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0.000 vzorek1 vzorek9 B 0.250 vzorek2 C 0.500 vzorek3 D 0.750 vzorek4 E 1.000 vzorek5 F 1.500 vzorek6 G 2.000 vzorek7 H 2.500 vzorek8 Výsledky měření Prompt #1: ReadingDate: 11/3/2014 ReaderName: PowerWave ReadingTime: 10:01:09 SoftwareVersion: Ver 3.4 Rev 21 DataFileName: NewPlate ProtocolFileName: BCA.prt ReadingType: Reader LagTime: 0:00:00 ReadMode: Normal PreHeating: No Filter1: 562 nm ShakingIntensity: 1 ReadingZone: A1-H12 ShakingDuration: 10 s Plate Title "červené hodnoty - odlehlé, nezapadají do trendu, doporučuji ignorovat" "oranžové hodnoty - jeví se jako odlehlé vůči ostatním opakováním nebo vzorkům, doporučuji ignorovat" 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0.298 0.268 0.241 0.510 0.523 0.509 0.587 0.580 0.566 0.031 0.031 0.032 562 B 0.324 0.312 0.297 0.824 0.527 0.340 0.030 0.029 0.029 0.028 0.029 0.030 C 0.364 0.375 0.358 0.251 0.259 0.253 0.031 0.030 0.030 0.031 0.031 0.030 D 0.336 0.278 0.273 0.551 0.570 0.550 0.033 0.031 0.032 0.031 0.030 0.035 E 0.339 0.372 0.374 0.686 0.562 0.513 0.032 0.031 0.030 0.033 0.032 0.032 F 0.367 0.396 0.414 0.833 0.601 0.431 0.032 0.038 0.028 0.035 0.034 0.032 G 0.406 0.413 0.426 0.442 0.480 0.482 0.031 0.032 0.034 0.034 0.033 0.031 H 0.476 0.475 0.474 0.721 0.519 0.327 0.030 0.032 0.036 0.033 0.030 0.031 Vyhodnocení c stdu BSA (mg/mL) Ředění Finální c stdu BSA (mg/mL) A1 A2 A3 Průměr A SD Cv% 0.0 (Blank) 0.75 0 0.25 0.75 0.188 0.5 0.75 0.375 0.75 0.75 0.563 1 0.75 0.75 1.5 0.75 1.125 2 0.75 1.5 2.5 0.75 1.875 Kalibrační přímka: A(562nm) = SLOPE * c (mg/mL) + INTERCEPT SLOPE (Směrnice): #DIV/0! Intercept: #DIV/0! Objem (neředěného) vozrku obsahující Vzorek Ředění A1 A2 A3 C1 C2 C3 Průměr C SD Cv% 15 ug proteinu: 1 0.25 uL 2 0.25 uL 3 0.25 uL 4 0.25 uL 5 0.25 uL 6 0.25 uL 7 0.25 uL 8 0.25 uL 9 0.25 uL ##### Sheet/List 3 ##### Popis desky Plate Title Standard BSA (uvedeny jsou koncentrace zásobních roztoků - není zohledněno ředění 3/4 před testem!) Vzorky Vzorky 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 2.500 vzorek1 vzorek9 B 2.000 vzorek2 C 1.500 vzorek3 D 1.000 vzorek4 E 0.750 vzorek5 F 0.500 vzorek6 G 0.250 vzorek7 H 0.000 vzorek8 Výsledky měření Prompt #1: ReadingDate: 11/7/2014 ReaderName: PowerWave ReadingTime: 14:36:55 SoftwareVersion: Ver 3.4 Rev 21 DataFileName: 141107-proteiny_cviko.pla ProtocolFileName: NewProtocol ReadingType: Reader LagTime: 0:00:00 ReadMode: Normal PreHeating: No Filter1: 562 nm ShakingIntensity: #N/A ReadingZone: A1-H12 ShakingDuration: #N/A s Plate Title 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0.885 0.902 0.941 0.457 0.456 0.458 0.3 0.315 0.336 0.03 0.033 0.033 562 B 0.751 0.793 0.827 0.482 0.496 0.513 0.089 0.095 0.092 0.029 0.031 0.031 C 0.634 0.656 0.689 0.388 0.416 0.42 0.09 0.091 0.095 0.03 0.031 0.032 D 0.53 0.523 0.571 0.466 0.498 0.465 0.033 0.032 0.036 0.032 0.032 0.036 E 0.404 0.422 0.46 0.497 0.481 0.491 0.032 0.033 0.03 0.033 0.033 0.031 F 0.334 0.346 0.362 0.435 0.441 0.441 0.027 0.041 0.031 0.034 0.033 0.03 G 0.228 0.248 0.251 0.498 0.484 0.506 0.026 0.035 0.032 0.038 0.035 0.031 H 0.151 0.143 0.134 0.463 0.397 0.474 0.03 0.04 0.031 0.035 0.035 0.027 Vyhodnocení c stdu BSA (mg/mL) Ředění Finální c stdu BSA (mg/mL) A1 A2 A3 Průměr A SD Cv% 0.0 (Blank) 0.75 0 0.25 0.75 0.188 0.5 0.75 0.375 0.75 0.75 0.563 1 0.75 0.75 1.5 0.75 1.125 2 0.75 1.5 2.5 0.75 1.875 Kalibrační přímka: A(562nm) = SLOPE * c (mg/mL) + INTERCEPT SLOPE (Směrnice): #DIV/0! Intercept: #DIV/0! Objem (neředěného) vozrku obsahující Vzorek Ředění A1 A2 A3 C1 C2 C3 Průměr C SD Cv% 15 ug proteinu: 1 0.25 uL 2 0.25 uL 3 0.25 uL 4 0.25 uL 5 0.25 uL 6 0.25 uL 7 0.25 uL 8 0.25 uL 9 0.25 uL 10 0.25 ##### Sheet/List 4 ##### Popis membrán Vyhodnocení Denzita Relativní Denzita (vůči kontrole) Normalizovaná denzita (vůči neovlivněnému proteinu) Fosfo-ERK (pERK) Celkový ERK (ERK) RD [pERK] RD [ERK] pERK1 / ERK1 pERK2 / ERK2 pERK1 pERK2 ERK1 ERK2 RD [pERK1] RD [pERK2] RD [ERK1] RD [ERK2] TM3 - kontrola #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! "TM3 - TPA, 10 nM, 30 min" #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! Relativní denzita - srovnání denzity proužků vůči kontrole (kontrola = 1.00) "Normalizovaná denzita - srovnání relativní denzity proužku zájmového proteinu v příslušném vzorku s relativní denzitou proužku neovlivněného proteinu (např. protein kontroly nanášení - house-keeping, nebo v našem případě celková MAPK ERK1/2)" "(v tomto experimentu šlo o zhodnocenípodílu fosforylované MAPK ERK1/2 vůči celkovému množství ERK1/2, které by nemělo být krátkodobou expozicí TPA prakticky ovlivněno, proto jsou hodnoty pERK normalizovány na celkový ERK)" Postup: Denzitometrická analýza pomocí programu ImageJ ke stažení => http://imagej.nih.gov/ij/ 1) Otevřít obrázek s analyzovanými / srovnávanými bandy - phosphoERK.tif "2) Vybrat na liště nástrojů ""Rectangular selection"" a vytvořit obdélník ohraničující bandy pERK1/2 v kontrolním vzorku" 3) Stisknout Ctrl+1 (v obdélníku se objeví číslovka 1) "4) Přetáhnout pomocí myši vytvořený obdélník č. 1 na místo ohraničující bandy vzorku ""TPA""" 5) Stisknout Ctrl+2 (v druhém obdélníku se objeví číslovka 2) 6) Stisknout Ctrl+3 7) Objeví se denzitometrický profil vzorků - píky odpovídají profilu intenzity signálu jednotlivých bandů "8) Vybrat na liště nástrojů ""(Straight) Line selection"" a:" a) označit základní linii píků b) rozdělit dvojici píků svislou čarou vedenou dnem údolí mezi píky "9) Vybrat na liště nástrojů ""Wand (Tracing) Tool""" "10) Kliknout ""Wand"" hůlkou postupně doprostřed jednotlivých píků (hranice píku se zvýrazní)" "11) V nabídce ""Analyze"" vybrat ""Gels"" a následně kliknout na ""Label Peaks""" "12) Objeví se tabulka s hodnotami plochy píků (""Area"") a jejich relativní velikosti vůči celkové ploše (""Percent"")" "(POZNÁMKA: pořadí hodnot v tabulce odpovídá pořadí, v jakém byly píky vybrány pomocí ""Wand"" hůlky)" "13) Obrázky s píky s hodnotami vložte prosím sem (použít v ImageJ funkci ""Copy To System"" v záložce ""Edit"", pak Ctrl+V)" "14) Hodnoty ""AREA"" nebo ""Percent"" dosadit do tabulky na začátku tohoto souboru" => vypočte se relativní denzita bandů "15) Celý postup opakovat s obrázkem celkového ERK1/2, tzn. totalERK1/2.tif" => proběhne normalizace relativních denzit podle denzity neovlivněného proteinu (v tomto případě totalERK) PODROBNOSTI viz http://lukemiller.org/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-image-j/ (obrázek s píky prosím vložit sem)