ÚLOHA č. 1
Extrakce proteinů z tkáňových kultur pro detekci pomocí SDS-PAGE/Western blot
Buněčná kultura:
• Linie myších Leydigových buněk TM3 - konfluentní buněčná kultura na 35 mm Petriho miskách
(před zahájením experimentu a před zahájením extrakce proteinů provést mikroskopickou
kontrolu buněk, zaznamenat změny v konfluenci, morfologii)
Chemikálie:
•••• Lyzační pufr (modifikováno podle Wisniewski et al. 2009, Nature Methods 6(5)):
Tris 20 mM-SDS 4%-DTT 1 mM, pH 7.6, s přídavkem inhibitorů fosfatáz a proteáz (1X PHOSStop,
1X cOmplete MINI Protease Inhibitor Cocktail, výrobce Roche)
Příprava lyzačního pufru: Recept pro 10 mL:
- 1M roztok Tris báze
(6.057 g/50 mL, pH upraveno 7.6, skladováno při laboratorní teplotě) -> 200 uL
- 1M DTT (154.25 mg/mL, skladováno při -20C) -> 10 uL
- 20%SDS (20 g/100 mL, skladováno při laboratorní teplotě) -> 2 mL
- 1X PHOS-Stop (skladováno při 4C) -> 1 tableta
1X cOmplete MINI Protease Inhibitor Cocktail (skladováno při 4C) -> 1 tableta
Doplnit
destilovanou vodou na 10 mL, důkladně
rozpustit tablety, promíchat
Poznámka: pokud možné, připravit lyzační pufr čerstvý, případné zbytky pro další použití
skladovat při -20C. Uchovejte alikvot lyzačního pufru společně se vzorky pro pozdější ředění
kalibračních roztoků pro kolorimetrické stanovení koncentrace proteinů.
•••• PBS (phosphate-buffered saline, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 8.1 mM, KH2PO4 1.5
mM, pH 7.2-7.4), chlazený
Pomůcky:
•••• automatické pipety (2-20 uL, 20-200 uL, 100-1000uL)
•••• 10 mL pipeta, pipetovač
•••• škrabka na buňky, oplachovací kádinka s vodou, papírové ubrousky
•••• odpadní kádinka
•••• značené 1.5-2.0 mL mikrozkumavky, krabička na vzorky
•••• ultrazvukový homogenizátor (Bandelin Sonopuls Mini20), krabice s ledem, střička s destilovanou
vodou
•••• vortex, minicentrifuga
Postup:
1. Buňky pěstované na 35 mm Petriho miskách, případně exponované podle požadavků.
Poznámka: Při extrakci konfluentní buněčné kultury lze počítat s výtěžkem extrakce zpravidla v
rozmezí 30-60 µg/cm
2
, tzn. z 35 mm misky o obsahu 9 cm
2
lze získat cca 270-540 µg proteinů
2. Po ukončení expozice / experimentálního zásahu: vylít/odsát kultivační médium, opláchnout buňky
3x2 mL chlazeného PBS
(odpadní médium je nutné dekontaminovat pomocí savo, v případě, že buňky byly exponovány
toxickým chemickým látkám, je nutné médium zlikvidovat jako nebezpečný odpad)
3. Naklonit misku a pomocí papírového ubrousku v rohu misky odsát zbytky PBS (nedotýkat se
ubrouskem dna misky s kulturou buněk!)
4. Napipetovat 150 µL lyzačního pufru do středu misky (před přidáním pufr krátce zvortexovat a
zkontrolovat, zda nedošlo k jeho vysrážení)
Poznámka: Při použití misek nebo mikrotitračních desek jiného formátu aplikovat lyzační pufr v
objemu 10-15 µL na 1 cm
2
plochy misky / jamky mikrotitrační desky.
5. Pomocí suché a čisté škrabky rozetřít lyzační pufr po celé ploše dna misky, seškrábnout buňky (každé
místo několikrát) a přenést lyzát do popsané mikrozkumavky. Mikrozkumavku umístit na led / do
chladícího stojánku (případně zamrazit, pokud následující kroky nebudou prováděny v těsné
návaznosti)
6. Buněčné lyzáty homogenizovat pomocí ultrazvukového homogenizátoru s ponornou sondou.
Opláchnout sondu MilliQ vodou, otřít papírovým ubrouskem, ponořit hrot sondy do lyzátu, těsně nade
dno mikrozkumavky. Zahájit sonikaci, během ní by se hrot sondy neměl přímo dotýkat dna zkumavky
(pohlcuje ultrazvukvé vlny a sonikace bude méně účinná), ale ani se přiblížovat příliš k hladině vzorku
(dojde k napěnění vzorku a opět ke snížení účinnosti sonikace).
Poznámka: Optimální parametry sonikace (síla, doba trvání sonikace, délka pulzů) budou záviset na
typu homogenizátoru, typu sondy a objemu vzorku. Sonikace by měla být dostatečně účinná, aby
došlo k rozrušení molekul DNA, které jsou zodpovědné za vysokou viskozitu vzorku. Dobře
homogenizovaný vzorek je možné bez potíží pipetovat pomocí mikropipety (nedochází k ucpávání
špičky). Na druhou stranu, během sonikace by nemělo docházet k extrémnímu přehřívání vzorků
(může způsobovat degradaci některých proteinů). V případě přílišného zahřívání je možné sonikaci
provést v několika krocích, mezi kterými je možné vzorky zchladit na ledu.
7. Odstranit buněčný debris centrifugací při 15 000 x G (10 min, 4C)
8. Supernatanty s vyextrahovanými proteiny před skladováním alikvotovat do mikrozkumavek pro
minimalizaci počtu rozmražení-zamražení při opakovaném používání vzorků (zamražení-rozmražení
způsobuje degradaci proteinů)
9. Vzorky skladovat zamražené (-20C, dlouhodobě -80C)