1 Bi5596 Moderní metody v ekotoxikologii STUDIUM RNASTUDIUM RNA && DNADNA IIII.. Co nCo nááss zajzajíímmáá a jak to zjista jak to zjistíímeme RNDr. Iva Sovadinová, Ph.D. sovadinova@recetox.muni.cz podzim 2014 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY Jak namnožit NK Jak zjistit sekvenci NK Co to je transkriptom a k čemu nám je Co to je (eko)toxigenomika Jak zapnout či vypnout gen Jak zkoumat genotoxicitu CO NCO NÁÁS, (EKO)TOXIKOLOGYS, (EKO)TOXIKOLOGY,, ZAJZAJÍÍMMÁÁ PPŘŘII STUDIU NUKLEOVÝCH KYSELINSTUDIU NUKLEOVÝCH KYSELIN?? 3 NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE ⇒ analýza variací POLYMORFISMUS DNA ⇒ bodový nebo repetitivní GENETICKÝ OTISK OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA MUTACE GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE REKOMBINACE DNA NK:NK: PROPROČČ ZKOUMZKOUMÁÁME?ME? 4 PCRPCR anebaneb JAK NAMNOJAK NAMNOŽŽIT SPECIFICKÝIT SPECIFICKÝ ÚÚSEK NKSEK NK?? 5 PCRPCR:: „„KOPKOPÍÍRKARKA““ PRO DNAPRO DNA PCR = „Polymerase Chain Reaction“ Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983 ⇒ Kary Mullis Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy ⇒ replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 6 PCRPCR:: „„KOPKOPÍÍRKARKA““ PRO DNAPRO DNA PCR = „Polymerase Chain Reaction“ Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983 ⇒ Kary Mullis Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy ⇒ replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 7 PCRPCR:: „„KOPKOPÍÍRKARKA““ PRO DNAPRO DNA PCR = „Polymerase Chain Reaction“ Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983 ⇒ Kary Mullis Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy ⇒ replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 8 240 = 1 099 511 627 776 kopií 9 PCRPCR:: CCOO POTPOTŘŘEBUJEMEEBUJEME?? I.I. 1. TEMPLÁT DNA 2. PRIMERY ⇒ Specifické pro např. – gen (receptor, enzym, membránový přenašeč atd.) – kmen bakterií (16S RNA) ⇒ Nespecifické 10 20 až 30 bazí Teplota nasedání závislá na sekvenci primerů (~ 50% obsahu GC) Neměl by tvořit sekundární struktury, zejména na 3’ konci Neměly by tvořit tzv. dimery ⇒⇒⇒⇒ komplementarita sekvencí primerů Sekvence primerů by měla končit GC ⇒⇒⇒⇒ silnější vazba ńa templát 20 až 30 bazí Teplota nasedání závislá na sekvenci primerů (~ 50% obsahu GC) Neměl by tvořit sekundární struktury, zejména na 3’ konci Neměly by tvořit tzv. dimery ⇒⇒⇒⇒ komplementarita sekvencí primerů Sekvence primerů by měla končit GC ⇒⇒⇒⇒ silnější vazba ńa templát PCRPCR:: (NE)SPECIFICK(NE)SPECIFICKÉÉ PRIMERYPRIMERY 5’-ACGGATACGTTACGCTGAT-3’ 3’-GACTATTCCATGTAGACCT-5’ Primer 1 5’-ACGGATACGTTACGCTGATAAGGTACATCTGGA-3’ 3’-TGCCTATGCAATGCGACTATTCCATGTAGACCT-5’ Primer 2 11 PCRPCR:: PROGRAMY PRO DESIGNOVPROGRAMY PRO DESIGNOVÁÁNNÍÍ PRIMERPRIMERŮŮ OLIGO www.oligo.ne PRIMER3 http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi PrimerQuest http://www.idtdna.com/primerquest/home/index OLIGO www.oligo.ne PRIMER3 http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi PrimerQuest http://www.idtdna.com/primerquest/home/index 12 PCRPCR:: CCOO POTPOTŘŘEBUJEMEEBUJEME?? II.II. 3. PŘÍSTROJ umožňující rychlé a precisní střídání teplot 95 °C ⇒⇒⇒⇒ denaturace DNA 50-60 °C ⇒⇒⇒⇒ nasednutí primerů 72 °C ⇒⇒⇒⇒ prodloužení vlákna 13 Průběh PCR před vynalezením thermocykleru Průběh PCR před vynalezením thermocykleru 8 NUDNÝCH hodin !!!8 NUDNÝCH hodin !!! 95º C 5 min 95º C 5 min 35 cyklů35 cyklů 55º C 3 min 55º C 3 min 72º C 5 min 72º C 5 min 14 Průběh PCR před vynalezením thermocykleru Průběh PCR před vynalezením thermocykleru 8 NUDNÝCH hodin !!!8 NUDNÝCH hodin !!! 95º C 5 min 95º C 5 min 35 cyklů35 cyklů 55º C 3 min 55º C 3 min 72º C 5 min 72º C 5 min 15 Automatizace „Baby Blue“ (1986) G-STORM GS4 (2006) Starší prototyp termocykleru Biometra T1 (1999) Techne TC-PLUS (2010) Eppendorf Mastercycler EP (2003) AUTOMATIZACE Biometra Toptical (2012) 16 PCRPCR:: CCOO POTPOTŘŘEBUJEMEEBUJEME?? III.III. 5. REAKČNÍ SMĚS VE ZKUMAVCE Vzorek DNA Primery pro (ne)specifickou detekci Nukleotidy Enzym 17 18 www.zivaveda.ivb.cz Polymerázová řetězová reakce aneb Děkujeme, pane Mullis!, Mgr. Tereza Králová T AC Taq DNA (templát)DNA (templát) Termostabilní DNA polymeráza (Tag polymeráza) Termostabilní DNA polymeráza (Tag polymeráza) Volné deoxynukleotidyVolné deoxynukleotidy G ddH2OddH2O HořčíkHořčík SloSložžkykyPCRPCR:: PrimeryPrimery PufrPufr + + A C T G VIDEO ⇒ http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-chain-reaction-PCR-3D-animation.html 1. DENATURACE 2. NASEDÁNÍ PRIMERŮ 3. PRODLUŽOVÁNÍ PRIMERŮ Clin. Microbiol. Rev. October 2004 vol. 17 no. 4 903-925 19 Obvyklé teploty & časy PCRObvyklé teploty & časy PCR 4o C4o CUkončení reakce Ukončení reakce 5 – 10 min 5 – 10 min 70o – 75o C70o – 75o CKonečné prodlužování Konečné prodlužování 0.5 – 2 min 0.5 – 2 min 70o – 75o C70o – 75o C Prodlužování primerů Prodlužování primerů 0.5 – 1 min 0.5 – 1 min 45o – 65o C45o – 65o CNasedání primerů Nasedání primerů 0.5 – 1 min 0.5 – 1 min 90o – 95o C90o – 95o CDenaturaceDenaturace 1 – 3 min 1 – 3 min 90o – 95o C90o – 95o CPočáteční denaturace Počáteční denaturace 20 – 40 cyklů 20 – 40 cyklů 20 Obvyklé teploty & časy PCRObvyklé teploty & časy PCR 4o C4o CUkončení reakce Ukončení reakce 5 – 10 min 5 – 10 min 70o – 75o C70o – 75o CKonečné prodlužování Konečné prodlužování 0.5 – 2 min 0.5 – 2 min 70o – 75o C70o – 75o C Prodlužování primerů Prodlužování primerů 0.5 – 1 min 0.5 – 1 min 45o – 65o C45o – 65o CNasedání primerů Nasedání primerů 0.5 – 1 min 0.5 – 1 min 90o – 95o C90o – 95o CDenaturaceDenaturace 1 – 3 min 1 – 3 min 90o – 95o C90o – 95o CPočáteční denaturace Počáteční denaturace 20 – 40 cyklů 20 – 40 cyklů nasedánínasedání 94ºC94ºC 94ºC94ºC 55ºC55ºC 72ºC72ºC 4ºC4ºC 3 min3 min 1 min1 min 45 sec45 sec 1 min1 min ∞ udržování∞ udržování Počáteční denaturace DNA Počáteční denaturace DNA 1X1X 35X35X 1X1X prodlouženíprodloužení denaturacedenaturace 21 22 PCRPCR:: JAK DETEKUJEME NAMNOJAK DETEKUJEME NAMNOŽŽENENÉÉ KOPIEKOPIE DNA?DNA? GELOVÁ ELEKTROFORÉZA horizontální elektroforéza na agarózovém gelu DNA fragmenty: 100 až 300 pb http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html 23 potvrzení specificity fragmentu sekvenačními metodami PCRPCR:: JAK DETEKUJEME NAMNOJAK DETEKUJEME NAMNOŽŽENENÉÉ KOPIEKOPIE DNA?DNA? GELOVÁ ELEKTROFORÉZA horizontální elektroforéza na agarózovém gelu DNA fragmenty: 100 až 300 pb http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html ⇒KONVENČNÍ PCR („end-point“ PCR) 24 potvrzení specificity fragmentu sekvenačními metodami http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html KONVENKONVENČČNNÍÍ PCRPCR:: LIMITACELIMITACE 25 ↓↓↓↓ citlivost ↓↓↓↓ rozlišení ↓↓↓↓ dynamický rozsah < 2 logs neautomatizovatelná pouze rozlišení velikosti ethidium bromid je spíše pro semikvantitativní barvení KONVENKONVENČČNNÍÍ PCRPCR:: LIMITACELIMITACE 26 qPCRqPCR:: DETEKCE V REDETEKCE V REÁÁLNLNÉÉMM ČČASEASE kvantitativnkvantitativníí PCRPCR http://www.gene-quantification.de/block.html 27 ⇒ fluorescenční barva vázající se na dsDNA http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/sybr-green-based-qpcr/syber-green- animation.html qPCRqPCR:: SYBR GREEN ISYBR GREEN I 28 ⇒ fluorescenční barva vázající se na dsDNA http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/sybr-green-based-qpcr/syber-green- animation.html qPCRqPCR:: SYBR GREEN ISYBR GREEN I 29 DeBiasi R L , and Tyler K L Clin. Microbiol. Rev. 2004;17:903-925 30 DeBiasi R L , and Tyler K L Clin. Microbiol. Rev. 2004;17:903-925 https://dna.utah.edu/LightCycler/Top_LightCycler.html 31 ⇒⇒⇒⇒ limitace ⇒⇒⇒⇒ SYBRG GREEN se váže nespecificky na jakoukoliv dsDNA (“primer-dimer”, nespecifický produkt atd.) http://hrm-dyes.gene-quantification.info/ https://dna.utah.edu/LightCycler/Top_LightCycler.html 32 Fluorescenčně značené próby vázající se specificky na cílový produkt PCR DeBiasi R L , and Tyler K L Clin. Microbiol. Rev. 2004;17:903-925 qPCRqPCR:: PRPRÓÓBYBY 33 http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html 34 http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html 35 qPCRqPCR:: KVANTIFIKACEKVANTIFIKACE 36 qPCRqPCR:: KVANTIFIKACEKVANTIFIKACE 37 RTRT--((qq))PCRPCR:: PCR PRO RNAPCR PRO RNA “Reverse transcription polymerase chain reaction“ RNA (total, mRNA, miRNA) Reverzní transkriptáza Primery pro RT: oligodT specifický primer náhodný primer VIDEO ⇒⇒⇒⇒ https://www.youtube.com/watch?v=0 MJIbrS4fbQ http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction 38 RTRT--((qq))PCRPCR:: PCR PRO RNAPCR PRO RNA “Reverse transcription polymerase chain reaction“ RNA (total, mRNA, miRNA) Reverzní transkriptáza Primery pro RT: oligodT specifický primer náhodný primer VIDEO ⇒⇒⇒⇒ https://www.youtube.com/watch?v=0 MJIbrS4fbQ http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction 39 RTRT--((qq))PCRPCR:: KRITKRITÉÉRIARIA ÚÚSPSPĚĚŠŠNOSTINOSTI http://www.gene-quantification.de/optimization2.html#overview 40 RTRT--((qq))PCRPCR:: KRITKRITÉÉRIARIA ÚÚSPSPĚĚŠŠNOSTINOSTI http://www.gene-quantification.de/optimization2.html#overview 41 (RT)(RT)--((qq))PCRPCR:: KONTROLYKONTROLY KONTROLA „no-RT“ ⇒⇒⇒⇒ bez reverzní transkriptázy kontaminace genomovou DNA (využití primerů vázajících se na introny) kontaminace DNA PCR KONTROLA „NTC“⇒⇒⇒⇒ bez DNA templátu (DNA, cDNA) kontaminace DNA nespecifické produkty POZITIVNÍ KONTROLY http://bitesizebio.com/4074/the-pcr-controls-you-must-use/ 42 RTRT--((qq))PCRPCR:: KVANTIFIKACEKVANTIFIKACE http://www.gene-quantification.de/strategy.html využívá tzv. REFERENČNÍ GENY “housekeeping genes” stabilní exprese GAPDH, ββββ-Aktin, 18S RNA 43 RTRT--((qq))PCRPCR:: PUBLIKOVATELNOST DATPUBLIKOVATELNOST DAT The MIQE Guidelines - Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Clinical Chemistry 2009, 55(4): 611-622 http://miqe.gene-quantification.info/ http://www.rdml.org/MIQE_checklist.pdf 44 RTRT--((qq))PCRPCR:: PUBLIKOVATELNOST DATPUBLIKOVATELNOST DAT The MIQE Guidelines - Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Clinical Chemistry 2009, 55(4): 611-622 http://miqe.gene-quantification.info/ http://www.rdml.org/MIQE_checklist.pdf 45 ((qq))PCRPCR:: MODIFIKACEMODIFIKACE PCR ARRAY • více sad primerů ve 96j nebo 384 desce • exprese až 88 genů (96j deska) • stanovuje specifické produkty v jednotlivých jamkách desky • referenční geny • biologické dráhy ⇒ oprava DNA, buněčný cyklus, oxidativní stres, apoptóza, cytokiny & zánět, signální dráhy atd. 46 ((qq))PCRPCR:: MODIFIKACEMODIFIKACE PCR ARRAY • více sad primerů ve 96j nebo 384 desce • exprese až 88 genů (96j deska) • stanovuje specifické produkty v jednotlivých jamkách desky • referenční geny • biologické dráhy ⇒ oprava DNA, buněčný cyklus, oxidativní stres, apoptóza, cytokiny & zánět, signální dráhy atd. 47 PCR čip • mikrofluidní čip • rychlejší • není nutná standardní křivka při absolutní kvatifikaci • vysoká citlivost 48 PCR čip • mikrofluidní čip • rychlejší • není nutná standardní křivka při absolutní kvatifikaci • vysoká citlivost Lab Chip, 2008,8, 2121-2127 49 PCR čip • mikrofluidní čip • rychlejší • není nutná standardní křivka při absolutní kvatifikaci • vysoká citlivost Lab Chip, 2008,8, 2121-2127 50 Experimental needs PCR method advantages limitations determine if a target NA sequence is present or absent in a few samples standard or conventional •easy access to equipment •minimal cost •qualitative results only •post reaction handling determine quantities of target NA in many samples real-time •can generate quantitative results •can be sequence specific •more expensive than conventional •PCR speed is mid- level determine quantities of many target NA for a few samples PCR arrays •up to 88 genes can be measured per sample at a time •one array is needed per sample •costly for many samples detect target NA in the field microfluidic chip •fast results •small size •portable •specialized equipment •costly detect very low abundance NA targets or need extremely accurate quantitation digital and drop digital •very precise absolute quantitation •specialized equipment •Costly http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html 51 multiplex PCR • v jedné PCR směsi vícero primerových párů 52 „direct“ PCR • PCR bez přečištěné DNA nebo RNA 53 AFLP („Amplified fragment length polymorphism“) ⇒ Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů Princip • metoda založená na restrikci DNA dvěma enzymy • selektivní namnožení jen některých proužků • vizualizace proužků na gelu Využití • polymorfismus DNA • genetická variabilita • fylogenetické studie 54 AFLP („Amplified fragment length polymorphism“) ⇒ Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů Princip • metoda založená na restrikci DNA dvěma enzymy • selektivní namnožení jen některých proužků • vizualizace proužků na gelu Využití • polymorfismus DNA • genetická variabilita • fylogenetické studie http://www.nature.com/scitable/content/outline-of-the-aflp-procedure-41047 https://botany.natur.cuni.cz/dna/index.php?option=com_content&view=article&id=47:aflp- princip&catid=35:aflp&Itemid=55 55 RAPD-PCR („Random Amplified Polymorphic“ DNA) • krátké nespecifické primery (8–12 nukleotidů) • není potřeba znát sekvenci celé genomové DNA nebo studovaného úseku • VYUŽITÍ DNA polymorfismus genetický otisk otisk mikrobiální komunity 56 RAPD-PCR („Random Amplified Polymorphic“ DNA) • krátké nespecifické primery (8–12 nukleotidů) • není potřeba znát sekvenci celé genomové DNA nebo studovaného úseku • VYUŽITÍ DNA polymorfismus genetický otisk otisk mikrobiální komunity http://www.majordifferences.com/2013/02/difference-between-rapd-and-rflp.html#.VDD5SBawRSM RAPD 57 RAPD-PCR („Random Amplified Polymorphic“ DNA) • krátké nespecifické primery (8–12 nukleotidů) • není potřeba znát sekvenci celé genomové DNA nebo studovaného úseku • VYUŽITÍ DNA polymorfismus genetický otisk otisk mikrobiální komunity http://www.majordifferences.com/2013/02/difference-between-rapd-and-rflp.html#.VDD5SBawRSM RAPD RFLP 58 SSH-PCR („Suppression subtractive hybridization“ PCR) • dovoluje namnožit pouze cDNA fragmenty, které se liší mezi kontrolou („driver“) a experimentální skupinou („test“) https://cellularphysiology.wikispaces.com/Suppression+subtractive+hybridization+%28SSH%2959 ((qq))PCRPCR:: APLIKACEAPLIKACE o klonování DNA o sekvenace DNA o fylogenetické analýzy založené na DNA o genetická diverzita o genetický otisk o detekce genu o exprese genu a jejich funkce o mutace 60 61 ((qq))PCRPCR:: POLYMORFISMUS DNAPOLYMORFISMUS DNA VNTR – variabilní počet tandémových repetitivních sekvencí http://www.thenakedscientists.com/HTML/uplo ads/tx_naksciimages/dalya8_vntr_diagram.gif Typy sekvencí DNA • jedinečné sekvence ⇒ geny (člověk – 80-100 000) • repetitivní sekvence ⇒ tandemové - bloky opakujících se repetitivních sekvencí uspořádaných za sebou satelitní DNA minisatelitní DNA mikrosatelitní DNA ⇒ rozptýlené SINE – krátké rozptýlené repetice LINE – dlouhé rozptýlené repetice 62 ((qq))PCRPCR:: POLYMORFISMUS DNAPOLYMORFISMUS DNA VNTR – variabilní počet tandémových repetitivních sekvencí http://www.thenakedscientists.com/HTML/uplo ads/tx_naksciimages/dalya8_vntr_diagram.gif Typy sekvencí DNA • jedinečné sekvence ⇒ geny (člověk – 80-100 000) • repetitivní sekvence ⇒ tandemové - bloky opakujících se repetitivních sekvencí uspořádaných za sebou satelitní DNA minisatelitní DNA mikrosatelitní DNA ⇒ rozptýlené SINE – krátké rozptýlené repetice LINE – dlouhé rozptýlené repetice 63 ((qq))PCRPCR:: POLYMORFISMUS DNAPOLYMORFISMUS DNA VNTR – variabilní počet tandémových repetitivních sekvencí http://www.thenakedscientists.com/HTML/uplo ads/tx_naksciimages/dalya8_vntr_diagram.gif Mikrosatelity • krátké tandemové repetice STR („short tandem repeats“) • repetice jednoduchých sekvencí SSR („simple sequence repeats“) • kódující i nekódující oblasti • hlavní zdroj vysoké proměnlivosti – sklouznutí nukleotidového řetězce během replikace („replication slippage“) • alely se liší delkou 64 Osobní stránky K. Mullise, obsahují popis objevu a principu PCR (vč. videa) http://www.karymullis.com/pcr.shtml Video o průběhu PCR http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU PCR song, povedená píseň firmy BioRad http://www.youtube.com/watch?v=x5yPkxCLads PCR song, text http://bio- rad.cnpg.com/lsca/videos/ScientistsForBetterPCR/assets/BioRad_PCRsong_ Lyrics.pdf PCRPCR:: UUŽŽITEITEČČNNÉÉ ODKAZY I.ODKAZY I. 65 66 PCRPCR:: UUŽŽITEITEČČNNÉÉ ODKAZY II.ODKAZY II. Kvantifikace qPCR http://www.gene-quantification.de Fóra, diskusní skupiny http://www.researchgate.net/topics http://www.bio.net/ www.molecularstation.com www.protocol-online.org molecularbiology.forums.biotechniques.com www.scienceforums.net www.biotechnologyforums.com www.biology-online.org 67 JAK ZJISTJAK ZJISTÍÍME SEKVENCI NKME SEKVENCI NK?? 68 NK:NK: SEKVENOVSEKVENOVÁÁNNÍÍ 1) Předstupeň: PCR s použitím dvojice primerů • namnožení studovaného úseku DNA 2) Sekvenační reakce • použití pouze jednoho primeru • produkce fragmentů lišících se přesně o 1 bázi 3) Elektroforetická separace fragmentů na gelu 69 SEKVENOVSEKVENOVÁÁNNÍÍ:: SANGEROVA METODASANGEROVA METODA Sangerova metoda terminace řetězce • založena na terminaci replikace nového řetězce podle matrice zkoumané sekvence dideoxynukleozidtrifosfátem (ddNTP) • na 3’-uhlíku deoxyribózy chybí OH - skupina a proto k nim DNA polymeráza nemůže navázat další nukleotid • pokud během replikace dojde k náhodné inkorporaci dideoxynukelotidu (ddA, ddC, ddG, ddT), replikace se zde zastaví 70 https://www.youtube.com/watch?v=oYpllbI0qF8 http://biologie.upol.cz/metody/Sekvenovani%20DNA.htm 71 https://www.youtube.com/watch?v=oYpllbI0qF8 http://biologie.upol.cz/metody/Sekvenovani%20DNA.htm 72 https://www.youtube.com/watch?v=oYpllbI0qF8 http://biologie.upol.cz/metody/Sekvenovani%20DNA.htm 5' ACGATTCGGCACT 3' 73 SEKVENOVSEKVENOVÁÁNNÍÍ:: DATABDATABÁÁZE DNAZE DNA 74 http://web.natur.cuni.cz/zoologie/biodiversity/prednasky/GenetickeMetodyVZoolo gii/Prednasky_2012/NextGenerationSequencing_2012.pdf SEKVENOVSEKVENOVÁÁNNÍÍ:: MODERNMODERNÍÍ METODYMETODY Pyrosekvenování • detekce aktivity DNA-polymerázy během syntézy DNA 75 http://web.natur.cuni.cz/zoologie/biodiversity/prednasky/GenetickeMetodyVZoolo gii/Prednasky_2012/NextGenerationSequencing_2012.pdf SEKVENOVSEKVENOVÁÁNNÍÍ:: MODERNMODERNÍÍ METODYMETODY Pyrosekvenování • detekce aktivity DNA-polymerázy během syntézy DNA 76 RNA-seq (RNA Sequencing), "Whole Transcriptome Shotgun Sequencing"("WTSS") • sekvenování RNA (total, mRNA, siRNA, miRNA atd.) http://www.labome.com/method/RNA-seq-Using-Next-Generation-Sequencing.html#ref277 • Stanovení genové exprese • Objevení a popsání všech transkriptů • Charakterizace alternativního sestřihu (hranice exonintron) a polyadenylace http://rnaseq.uoregon.edu/ 78 • Stanovení genové exprese • Objevení a popsání všech transkriptů • Charakterizace alternativního sestřihu (hranice exonintron) a polyadenylace http://rnaseq.uoregon.edu/ Front. Plant Sci., 28 August 2012 79 Transl Lung Cancer Res 2013;2(2):87-91 80 JAK STUDUJEME INTERAKCE GENJAK STUDUJEME INTERAKCE GENŮŮ AA PROSTPROSTŘŘEDEDÍÍ?? 81 NKNK:: TRANSKRIPTOMIKATRANSKRIPTOMIKA Aquatic Toxicology 67 (2004) 143–154 82 NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 5 | DECEMBER 2004 | 937 83 NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 5 | DECEMBER 2004 | 937 84 TRANSKRIPTOMIKATRANSKRIPTOMIKA:: METODYMETODY TRANSKRIPTOM ⇒⇒⇒⇒ výčet a kvantifikace RNA v buňce, tkáni nebo organismu (mRNA, microRNA, siRNA, dlouhá nekódující RNA) METODY ⇒⇒⇒⇒ qPCR ⇒⇒⇒⇒ RNA-seq ⇒⇒⇒⇒ microarray 85 TRANSKRIPTOMIKATRANSKRIPTOMIKA:: DNA array aDNA array a ččipip DNA ARRAY a čip • dvouřetězcové úseky molekul cDNA (komplementární DNA) vzniklé reverzní transkripcí mRNA • oligonukleotidové sondy sekvenčně specifické pro každý gen z genomu • hybridizační technika • vychází z tzv. Northern blotu ⇒ imobilizována mRNA se hybridizuje se značenou probou reprezentující jeden gen • geny nebo fragmenty genů (cDNA, EST) jsou roboticky v přesně daných souřadnicích umístěny na mikroskopické sklo (plast) 86 PRINCIP • funguje na principu specifické hybridizace ⇒ na principu párování komplementárních bází nukleotidů (spojení vodíkovými můstky) • destička (skleněná nebo silikonová) s mnoha (běžně desetitisíci, statisíci, výjimečně až miliony) vzorky jednovláken DNA oligonukleotidů nebo cDNA Klin. Biochem. Metab., 14 (35), 2006, No. 2, p. 89–95.87 POSTUP: 1. Vytvoření DNA čipu Navázáním oligonukleotidu (sondy) kovalentní vazbou na destičku 2. Příprava vzorku (cDNA nebo genomová DNA) nezbytný krok označení molekul (fluorescentní, radioaktivní) a denaturace 3. Hybridizace vzorku s čipem nanesení vzorku na čip 4. Omytí čipu sondy pevně přichycené kovalentní vazbou k povrchu čipu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. 5. Skenování čipu Vícekanálový skener 6. Zpracování výsledků podle intenzity vyzářeného světla lze určit množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/cgi/5.pdf88 POSTUP: 1. Vytvoření DNA čipu Navázáním oligonukleotidu (sondy) kovalentní vazbou na destičku 2. Příprava vzorku (cDNA nebo genomová DNA) nezbytný krok označení molekul (fluorescentní, radioaktivní) a denaturace 3. Hybridizace vzorku s čipem nanesení vzorku na čip 4. Omytí čipu sondy pevně přichycené kovalentní vazbou k povrchu čipu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. 5. Skenování čipu Vícekanálový skener 6. Zpracování výsledků podle intenzity vyzářeného světla lze určit množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/cgi/5.pdf89 POSTUP: 1. Vytvoření DNA čipu Navázáním oligonukleotidu (sondy) kovalentní vazbou na destičku 2. Příprava vzorku (cDNA nebo genomová DNA) nezbytný krok označení molekul (fluorescentní, radioaktivní) a denaturace 3. Hybridizace vzorku s čipem nanesení vzorku na čip 4. Omytí čipu sondy pevně přichycené kovalentní vazbou k povrchu čipu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. 5. Skenování čipu Vícekanálový skener 6. Zpracování výsledků podle intenzity vyzářeného světla lze určit množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/cgi/5.pdf90 Cell Biosci. 2012;2:26 91 NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 5 | DECEMBER 2004 | 937 92 Aquatic Toxicology 67 (2004) 143–154 93 TRENDS in Biotechnology Vol.25 No.10 94 JAK VYTVOJAK VYTVOŘŘIT REKOMBINANTNIT REKOMBINANTNÍÍ MODELMODEL PRO (EKO)TOXIKOLOGIIPRO (EKO)TOXIKOLOGII?? 9595 REKOMBINACE DNAREKOMBINACE DNA:: REPORTREPORTÉÉROVROVÉÉ MODELYMODELY http://worldwide.promega.com/resources/multimedia/reporter-assays-and- transfection/introduction-to-reporter-gene-assays/ 96 REKOMBINACE DNAREKOMBINACE DNA:: REPORTREPORTÉÉROVROVÉÉ MODELYMODELY http://worldwide.promega.com/resources/multimedia/reporter-assays-and- transfection/introduction-to-reporter-gene-assays/ 97 http://en.wikipedia.org/wiki/Biomolecular_engineering 98 1. Promoter nebo 3’UTR responzivního elementu 2. Tvorba plazmidu a jeho namnožení (restrikční enzymy, klonování, selekce a izolace plazmidů) 3. Přenesení konstruktu (plazmidu) do buněk = transfekce http://www.activemotif.com/catalog/900/lightswitch-luciferase-assay-system 99 http://worldwide.promega.com 100 EHP 120 (2012): 990 101 REKOMBINACE DNAREKOMBINACE DNA:: JAK VYPNOUT GENJAK VYPNOUT GEN?? “GENE KNOCK OUT” ⇒ kombinace technik vede k vyřazení genu z provozu ⇒ DNA konstrukt přenesen do buněčné kultury ⇒ u zvířat jsou embryonální kmenové buňky geneticky upraveny a vneseny do ranního stádia embrya „GENE KNOCK-IN“ jedná se o nahrazení genu, ne o jeho vymazání „GENE KNOCK-DOWN“ jedná se o snížení či inhibici genové exprese 102 REKOMBINACE DNAREKOMBINACE DNA:: JAK VYPNOUT GENJAK VYPNOUT GEN?? “GENE KNOCK OUT” ⇒ kombinace technik vede k vyřazení genu z provozu ⇒ DNA konstrukt přenesen do buněčné kultury ⇒ u zvířat jsou embryonální kmenové buňky geneticky upraveny a vneseny do ranního stádia embrya „GENE KNOCK-IN“ jedná se o nahrazení genu, ne o jeho vymazání „GENE KNOCK-DOWN“ jedná se o snížení či inhibici genové exprese 103 104 http://www.nobelprize.org/nobel _prizes/medicine/laureates/2007/ advanced.html 105 “siRNA”, ribozymy, 106 JAK STUDUJEME GENO(EKO)TOXICITUJAK STUDUJEME GENO(EKO)TOXICITU?? 107 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: COMET ASSAYCOMET ASSAY http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/cancer-research/learning-center/cancer-researchprotocols/comet-assay.html 108 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: COMET ASSAYCOMET ASSAY http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/cancer-research/learning-center/cancer-research- protocols/comet-assay.html http://cometassayuoc.blogspot.cz/2010/03/introduction-to-comet-assay.html 109 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: MIKROJMIKROJÁÁDROVÝ TESTDROVÝ TEST http://www.gentronix.co.uk/product/micro-nucleus-test/ 110 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: FISHFISH http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327# 111 GENOTOXICITAGENOTOXICITA:: FISHFISH http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327# 112 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FISH_%28Fluorescent_In_Situ_Hybridization%29.jpg 113 114