STUDIUM ÚČINKŮ metabolitySTUDIUM ÚČINKŮ – metabolity
Analýza malých molekul (metabolitů) v
( )(eko)toxikologii
Lucie Bláhová, MU, RECETOX
Schéma přednášky
• Metabolity, metabolomikaMetabolity, metabolomika
• Příklady a význam vybraných metabolitů
Příklad přírodních látek• Příklady přírodních látek
• Metody stanovení
– Extrakce  Separace  Detekcep
• Vybrané příkladyVybrané příklady
– Thioly (GSH)
– Analýza lipidůAnalýza lipidů
Systémová biologie
Xenobiotika
Léčiva
Side
effect
Nutrienty
effect
M t b lit S k dá í t b litMetabolity Sekundární metabolity
Metabolity a malé molekuly v organismech
Metabolity Sekundární metabolity a Léčiva
NutrientyNutrienty
METABOLOMIKA
METABOLOM
Metabolit
• Produkt enzymové reakce
• Vyskytuje se převážně uvnitř
Příklad:
cholesterol-steroidní hormonyy y j p
buňky (!)
• Neakumuluje se
• Má biologickou funkci (na
enzymatické i transkripční úrovni)
y
(kortisol - řízení metabolismu všech živin)
enzymatické i transkripční úrovni)
• Podobná struktura s prekurzorem
• Nízká koncentrace a malá MW
MetabolomMetabolom
Soubor nízkomolekulárních meziproduktů a koncových produktů genové
exprese a enzymatické aktivity v daném čase
METABOLOM – proč?METABOLOM proč?
Proč využít metabolom?Proč využít metabolom?
• Množství metabolitů obecně
nižší než počet genů a proteinů
b ň (S i i 600
Fluxome 13C
v buňce (S. cerevisiae – 600
metabolitů pod MW -300 z 6000 genů)
– Výjimky existují – např. u rostlin může být
naopak – sekundární metabolity
Genome Transcriptome Proteome Metabolome
• Analýzy časově méně náročné
– ve srovnání s analýzou velkých
makromolekul
Z ě hl di á h t b litů• Změny v hladinách metabolitů:
1. při nezměněné koncentraci
enzymu
2. násobně vyšší než změny exprese2. násobně vyšší než změny exprese
nebo koncentrace proteinů
3. dány nejen úrovní exprese, ale i
environmentálními vlivy, stádiem
vývoje organizmu biol cyklyvývoje organizmu, biol. cykly …
http://biomarkers.cardiosource.org/~/media/BioMarkers/Images/sabatinefig2.ashx
METABOLOM – jak?
Klesá počet analyzovaných molekul …
Roste chemická komplexnost analyzovaných sloučenin
RT-PCR
2D PAGE MALDI TOF
NMR
http://cancerdiscovery.aacrjournals.org/content/2/10/881.figures-only?cited-by=yes&legid=candisc;2/10/881
DNA Microarrays
Gene Chips
2D-PAGE MALDI-TOF
2D-LC-MS
GC-MS
LC-MS
CE-MS
METABOLOMIKA
Metabolomika:
Kvantitativní i kvalitativní studiumKvantitativní i kvalitativní studium
metabolitů <1 kDA (metabolomu)
látkové přeměny živých systémů
V žitíVyužití:
•Adaptace organizmu na prostředí
•Odhad toxicity látek
•Vývoj nových léčiv
•Hledání metabolických biomarkerů
a biomarkerů onemocnění
Bi k ůběh t i•Biomarkery průběhu terapie
•Charakterizace a identifiace buněk
(savčí, rostlinné, GMO)
METABOLOMIKA - přístupy
Metabolite target analysis:
• kvantitativní i kvalitativní analýza substrátů nebo produktů metabolické
dráhy, nízký LOD, náročná příprava vzorku
M t b li filiMetabolic profiling:
• semikvantitativní analýza více metabolitů s podobnými vlastnostmi
(např. polární lipidy, isoprenoidy, sacharidy)
Finger / Footprinting:
• komplexní analýza intra (finger-) a extracelulárních (foot-) metabolitů
bez nutnosti kvantifikovat a identifikovat, screening
Metabonomics (definice není 100%ní!):
• podoba s fingerprinting, cílem je sledovat odpověď po expozici např.
t i k látk (f k l i t ik l i )toxickou látkou (farmakologie, toxikologie)
• především analýza “metabolitů vznikajících z toxické látky”
Buňka, tkáň Biologické tekutiny
Frakce metabolitů
Derivatizace
H
Derivatizace
Čištěná frakce
metabolitů
Extrakt
Derivatizace
MS
GC
NMR
CE
NMR, FT-ICR
Finger/Footprinting
GC
HPLC
Derivatizace
MS MS ECD UV
LC
MS NMR MS
Metabolic profiling
MS MS ECD UV
Metabolite target analysis
Různé skupiny metabolitůp y
http://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/5900verviewmet.html
! Diskutován je heterotrofní metabolismus (živočichové, člověk)
(ne sinice, rostliny, a zvláštní typy bakterií ...)
METABOLITY LIPIDŮMETABOLITY LIPIDŮ
METABOLITY LIPIDŮ
Databáze Lipid MAPS (3.5.2013) – 37 500 biologicky relevantníchDatabáze Lipid MAPS (3.5.2013) 37 500 biologicky relevantních
lipidů
• Fatty acids 5795
Nepolární lipidy
• Fatty acids 5795
• Glycerolipids 7538
• Sterol lipids 2678Sterol lipids 2678
• Prenol lipids 1200
• Sacccharolipids 1293p
• Sphingolipids 4318
• Glycerophospholipids 8001y p p p
• Polyketides 6741 Polární lipidy
http://www.lipidmaps.org/
METABOLITY LIPIDŮ – dělení
Lipidy:
Polární x nepolárníPolární x nepolární
Jednoduché x složené x odvozené
Různé polohy acylů na glycerolu
Mastné kyseliny:
•Délka řetězce
•Počet dvojných vazeb a jejich umístěníj ý j j
•Stereoizomerie
•Regioizomerie
•Stejná MW, ale
různé polohy substituentů na řetězciy
Lisa M. J. Chromatogr.A 1218 (2011) : 5146
Fosfolipidyp y
Součást membrán
Složení
• Diacylglycerol-fosfát (může být esterifikován)
• Mastné kyseliny
– Palmitová, oleová, arachidonová
• Nejvíce prostudované a biologicky významné
 metabolity kyseliny arachidonové (AA)
METABOLITY FOSFOLIPIDŮ
Oxidace fosfolipidů
• nejčastější proces metabolizace
• ztráta funkčnosti membrán
• enzymaticky i neenzymatickyenzymaticky i neenzymaticky
• metabolity s fyziologickými účinky
• reaktivní metabolity
Diacylglycerol
Adukty s NB, proteiny
•Cholesterol
•Oxysterol
Acetyl-CoA
http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/biology/celmem.html
http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/bioprop/phospho.html
http://www.scielo.br/img/revistas/jbpneu/v35n12/en_a11fig03.gif
FOSFOLIPIDY – enzymatická oxidacey
Eikosanoidy
20 C, deriváty AA20 C, deriváty AA
• Prostaglandiny
• Tromboxany
• Leukotrieny
• Lipoxiny
• Hydroxyeikosatetraenové
k li HETE
Významné biologické funkce
•Zprostředkování zánětlivé odpovědi
•Buněčná signalizace
•Regulace krevního tlaku, koagulace, horečky, bolesti
kyseliny - HETE
http://www.arthritis.co.za/nsaids2.htm
Regulace krevního tlaku, koagulace, horečky, bolesti
•Řídí činnost ledvin
•Inhibice lipolýzy a sekrece trávicích šťáv
FOSFOLIPIDY – neenzymatická oxidaceFOSFOLIPIDY neenzymatická oxidace
Isoeikosanoidy
Produkty neenzymatické oxidace AA
Nejstudovanější – ISOPROSTANY
Stabilní molekuly specificky vznikají po ataku ROS• Stabilní molekuly, specificky vznikají po ataku ROS
• Nejznámější 8-iso-PGF2α
(synonyma iPF2α-III, iPF2α-IV, 15-F2t-IsoP)
Známé účinky 8-iso-PGF2α :
• vasokonstrikce
• inhibice shlukování krevních destiček
úč t ři á ětli ý h h• účast při zánětlivých procesech
Využití:
• biomarker oxidativního stresu a pracovní expozice
bi k d ti í h k di k lá í h• biomarker neurodegenerativních a kardiovaskulárních
onemocnění
• řízení terapeutického zásahu
http://pvac.vscht.cz/ustav/vyzkumne-projekty/biomarkery-oxidacniho-stresu
FOSFOLIPIDY – neenzymatická oxidaceFOSFOLIPIDY neenzymatická oxidace
Konečné produkty oxidacep y
= malé reaktivní aldehydy
MDA – malondialdehyd (MW 72.07)y ( )
HNE – 4-hydroxynonenal (MW 156.22)
ONE – 4-oxononenal (MW 155.22)
ACR – acrolein (MW 56.06)
• koncové produkty oxidace i potravních lipidů
• reaktivní malé molekuly – tvorba aduktů s DNA,
peptid GSH ( mercapt romika“)peptidy, GSH („mercapturomika“)
• biomarkery oxidativního stresu in vivo a vnější
expozice
• biologické a toxické účinkyg y
http://pvac.vscht.cz/ustav/vyzkumne-projekty/biomarkery-oxidacniho-stresu
DALŠÍ METABOLITY LIPIDŮ
Cholesterol
S čá t b á k t id í h h ů• Součást membrán, prekurzor steroidních hormonů a
žlučových kyselin
O t l (7b h d h l t l)Oxysteroly (7b-hydroxycholesterol)
• produkt lipidní peroxidace cholesterolu, MW 402.65
• biomarker oxidativního stresu a různých onemocněníý
(diabetes, atherosclerosis, liver diseases, alzheimer)
• vysoká koncentrace v plasmě
• biologické účinky: apoptoza, agregace destiček,
metabolismus sfingolipidů cytotoxicitametabolismus sfingolipidů, cytotoxicita
t-HODE (hydroxyoctadecadienoic acid)
• produkt oxidace kyseliny linoleové,
• biomarker antioxidační kapacity a oxidativního stresu in
vivo
METABOLITY PEPTIDŮMETABOLITY PEPTIDŮ
METABOLITY PEPTIDŮMETABOLITY PEPTIDŮ
METABOLITY PEPTIDŮ (1)( )
Aminokyseliny a jejich deriváty:
Proteinogenní
1) funkce strukturní (proteiny) – všechny aa
2) další funkce
př přenos vzruchu v CNS glycin kyselina asparagová kyselina glutamová- př. přenos vzruchu v CNS - glycin, kyselina asparagová, kyselina glutamová
Neproteinogenní – specifické funkce
* -alanin, N-methyl-d-asparagová kyselina NMDA (stimulátor mozkových receptorů),
* GABA (přenos vzruchu)
Metabolity aminokyselin:
th l l i ( k i ti ád é úči k )methylglycin (sarkosin - antinádorové účinky);
kreatin (derivát glycinu);
acetylcholin (mediátor vzruchu), cholin, ethanolamin (derivát serinu);
serotonin, melatonin (derivát tryptofanu, regulační funkce);
histamin (deri át histidin )
adrenalin
histamin (derivát histidinu);
hormony dřeně nadledvinek – př. adrenalin a štítné žlázy (deriváty tyrosinu);
3-nitrotyrosin, o-tyrosin, karboxymethyl nebo MDA adukt lysinu (biomarkery oxidativního stresu),
močovina (konečný metabolit degradace aminokyselin)
METABOLITY PEPTIDŮ (2)( )
Konjugáty peptidů:
Glykosilace, Cysteinylace, Glutathionylace, Oxidační produkty (karboxymethyl), Ubiquitace,
Adukty s reaktivními aldehydy
ANALÝZY peptidů – viz přednášky jinde (proteiny)
Příklad - kvantifikace oxidovaných proteinů
-homogenizace-
2Dgel elektroforéza-2Dgel elektroforéza
-immunoblotting nebo afinitní kolony-vyjmutí
skvrn
-trypsin
d k /d i ti / č í bi ti-redukce/derivatizace/značení biotinem-MS-protein
indentifikace (fingerprinting)
DALŠÍ KLÍČOVÉ METABOLITY
( h id kl tid )(sacharidy, nukleotidy)
METABOLITY SACHARIDŮMETABOLITY SACHARIDŮ
Jednoduché sacharidy:
Příklad: Glukóza
• Rozpustná ve vodě, zdroj energie, konstantní hladina v krvi
• Stanovení: enzymaticky, spektrofotometricky, amperometricky
Deriváty sacharidů:
Příklad: Kyselina glukuronová
• Konjugační agens v detoxikačních reakcích
Konjugáty sacharidů - glykoproteiny a glykolipidy:
Stanovení obtížné (mnoho struktur s různými chemickými vlastnostmi, často větvené
struktury, nízké koncentrace)
Příklad konjugujícího sacharidu: N-acetylglukosamin, glukóza, galaktóza, sialové kyseliny,
chondroitin sulfát deriváty
• Účinky: účastní se imunitních reakcí, buněčné diferenciace, markery nádorových
onemocnění, možná léčiva
St í LC/MS i hi t h i ELISA i l kt f é k• Stanovení: LC/MS, immunohistochemie, ELISA, microarray, elektroforéza s kys.
jodistou a Ag+
METABOLITY NUKLEOTIDŮMETABOLITY NUKLEOTIDŮ
kl tidnukleotidy:
• Adeninové nukleotidy a koenzymy (ATP, ADP, AMP, NADPH, NADH)
• Adukty bazí (8-oxodG, 8-OH-dA, dT-glycol, and 5-hydroxy-methyl-dU,Adukty bazí (8 oxodG, 8 OH dA, dT glycol, and 5 hydroxy methyl dU,
adukty s MDA-M1dG)
M1dG
léčiva na bázi nukleotidů:
M1dG
léčiva na bázi nukleotidů:
• 6-aza-uridin (cytostatika)-inhibice DNA syntézy
DALŠÍ “MALÉ MOLEKULY” V ORGANIZMU
MALÉ MOLEKULY V ORGANIZMU
• Přírodní látky
lé li tidmalé oligoeptidy,
biogenní aminy,
alkaloidy, polyfenoly,
barviva glykosidybarviva, glykosidy,
terpenoidy, sinicové
toxiny, mykotoxiny,
antibiotika vonné látkyantibiotika, vonné látky
• Další (ne v této přednášce)
• Farmaka -
antibiotika,
analgetika,
c tostatikacytostatika
• Nutrienty vitaminy,
cukry,
t é k li
Kromě endogenních metabolitů mohou i cizorodé malé molekuly modulovat
proces na šech úro ních (f iologické b něčné a molek lární) mastné kyselinyprocesy na všech úrovních (fyziologické, buněčné a molekulární).
PŘÍRODNÍ LÁTKY - příkladyp y
Biogenní aminy
• Dekarboxylace AA
Efedrin
• Dekarboxylace AA,
Efedrin, Histamin
AlkaloidyAlkaloidy
• Heterocykly – Nikotin
Anatoxin A
Anatoxin A
Polyfenoly
• Flavonoidy – antioxidanty,
Nicotin
pigmenty, UV ochrana
Oligopeptidy
Flavonová
struktura
Oligopeptidy
• Cyanobakteriální toxiny (microcystin)
Microcystin
PŘÍRODNÍ LÁTKY - příklady
Neproteinogenní aminokyseliny
p y
• Cyanobakteriální toxiny (domoic acid, BMAA)
• Rostlinný původ (L-DOPA, BOAA)
• inkorporace do proteinů  chyby patologie
p g y y
• inkorporace do proteinů  chyby, patologie
BMAA
BOAA
Vitamíny
• vit E (tokoferoly-lipid)
• vit C (kys askorbová-sacharid)• vit C (kys. askorbová-sacharid)
Vit C
METODY STUDIA METABOLOMUMETODY STUDIA METABOLOMU
Stanovení metabolitůStanovení metabolitů
Kultivace  Vzorkování 
Extrakce  Derivatizace
Zakoncentrování (SP(M)E)
 Separace (GC, LC, CE)
 A lý (NMR MS DAD FTICR) Analýza (NMR, MS, DAD, FTICR)
Vyhodnocení
Statistická analýza
Kim, H.K. et al.. Nature Protocols 5, 536 - 549 (2010)
Metabolit x Matrice (vzorek)Metabolit x Matrice (vzorek)
Matrice:
krev (rozpuštěné proteiny, lipidy, soli, sacharidy, suspendované
buňky)
plasma (centrifugací oddělené jen buňky (heparin, EDTA)
é ( dděl é b ňk áž í t i 5%)sérum (oddělené buňky a srážecí proteiny, cca 5%)
moč (soli, močovina, metabolity ve volné formě)
mléko (lipidy, proteiny, sacharidy)
tkáně (buňky proteiny lipidy sacharidy)tkáně (buňky, proteiny, lipidy, sacharidy)
dechový kondenzát (voda, částice)
sliny (99% voda, dále enzymy, soli, glykoproteiny)
Analyt:
nízkomolekulární látka
nízká a variabilní koncentrace v přítomnosti komplexní matrice
volná forma nebo vázané na proteiny (glucuronid, sulfát)
velká fyzikálně chemická variabilita
PŘÍPRAVA VZORKU
EXTRAKCEEXTRAKCE
Zastavení buněčného metabolismu (t=s)
Vzorkovací technika (tkáň, extracelulární méduim)o o ac ec a ( á , e ace u á édu )
Uvolnění analytu (homogenizace, rozbití, odstranění buněk)
Odstranění makromolekul, homogenizačního roztoku
Přečištění, zakoncentrování (SPE, LLE)
Derivatizace
Výměna rozpouštědel
Separace (LC CE GC)Separace (LC, CE, GC)
Homogenizaceg
Musilová J. Chem. Listy 105, 745 751 (2011)
Odstranění matrice
Odstranění makromolekul
• Klíčové je odstranění zejména peptidů/proteinů a lipidů
• Proteiny
Srážení– Srážení
– Hydrolýza (6N HCl, teplota, enzymaticky, mikrovlnná extrakce)
– Ultrafiltrace
Centrifugace– Centrifugace
• Lipidy
– Gelová permeační chromatografie
Odstranění homogenizačního roztoku
• Lyofilizace
• Sušárna
Přečištění - Zakoncentrování
LLE - extrakce kapalina-kapalinap p
• extrakce širokého množství látek, jednoduchá
• časová náročnost, variabilní výtěžnost, spotřeba materiálu
SFE - superkritická fluidní extrakce
CO2 v nadkritickém stavu, kapalina s vlastnostmi plynu (viskozita,
difuze)difuze)
(Elektro)dialýza - koncentrační rozdíl nebo rozdíl el. potenciálu
na polopropustné membráněp p p
Reverzní osmoza, ultrafiltrace - využití hydrostatického
tlaku
TLC – tenkovrstvá kapalinová chromatografie –
využití separace tříd lipidů před MALDI-MSy p p p
Přečištění – Zakoncentrování: SPEPřečištění Zakoncentrování: SPE
SPE - extrakce na tuhé fázi – často užívaná metoda (!)
• selektivita, automatizace, reprodukovatelnost, časová nenáročnost, malá
spotřeba rozpouštědel, miniaturizace, odsolení, výměna rozpouštědel,
zakoncentrování, možnost frakcionace
• různá kvalita sorbentu, ztráty analytu sorbcí nebo předčasnou elucí při
promytí, horší reprodukovatelnost mezi laboratořemi, kolonky na jedno
použitíp
Kondicionace
Aplikace vzorku
Oplach rozpouštědlem, odstranění nečistot z
výroby, příprava na solvataci (př. methanol/voda)
RychlostAplikace vzorku
Promytí, úprava pH
Rychlost
Nemusí se vždy využít, odstraní matrici
Sušení Odstranění nečistot bez ztráty analytu (voda)
Eluce Eluce rozpouštědlem – přerušení vazby analytu a
sorbentu (methanol)
Přečištění - Zakoncentrování: SPE
SPE výběr kolony (objem vzorku, vlastnosti matrice a analytu)
Nepolární interakce:p
• Reverzní fáze, na pevné fázi navázány uhlovodíkové řetězce (C18, Ph,
CN)
• Analyty - protonované nebo neutrální molekuly, aromáty, alifatické
řetězce
El lá í ž tř d ě lá í štědl• Eluce - nepolární až středně polární rozpouštědla
Polární interakce:
• Normální fáze, pevná fáze (silikagel) s modifikacemi
• Analyty aminy alkoholy fenoly karboxylové kyseliny aromatické• Analyty - aminy, alkoholy, fenoly, karboxylové kyseliny, aromatické
uhlovodíky, heterosloučeniny
• Eluce - středně polární až polární rozpouštědla
Iontově výměnné:ý
• Nabitý povrch částice (alkylsulfonáty, tetraalkylamoniová sůl)
• Analyty-organické kyseliny, mastné kyseliny
• Eluce – změna pH
fAfinitní interakce:
• Imobilizovaný ligand (protilátky) reagující s analytem
• Analyty – léčiva, potravinářství
Mix interakcí:Mix interakcí:
• Reverzní fáze se silnými/slabými kationtově/aniontově
výměnnými skupinami
Extrakce
Extrakce – vliv extrakčního postupu na
analýzu - příklad
A i i li ( id i K 9 4 l bili 9 7 /L) l ěAmitriptyline (antidepresivum, pKa 9.4, solubility 9.7 mg/L) v plasmě
Extrakce –vliv extrakčního postupu na
analýzu - příklad
A i i li ( id i K 9 4 l bili 9 7 /L) l ěAmitriptyline (antidepresivum, pKa 9.4, solubility 9.7 mg/L) v plasmě
http://www.chromatographyonline.com/lcgc/article/articleDetail.jsp?id=564645&pageID=2
Derivatizace
Příklad: Analysis of
Steroid Hormones in
1. androsterone
2. dehydroepiandrosterone
Steroid Hormones in
urine by GC/MS derivatizace
„Silylation“
• nezbytná pro GC
• stabilizuje molekuly
• vnáší chromo/elektrofory do
y p
(DHEA)
3. 17-α-estradiol
4. estrone
5. 17-β-estradiol
6. testosterone
• vnáší chromo/elektrofory do
molekuly analytu
• mění polární látky na více
li fil í
7. derivatization by-product
lipofilní
• zvyšuje sensitivitu signálu v
MS
Více : Hanbook of sample preparation (2010) ISBN 978-0-470-09934-6
SEPARACE A ANALÝZA
SeparaceSeparace
Chromatografie - dělení látek ze směsi mezi stacionární a
mobilní fází
oddělí i isomery (různá struktura), isobary (různé molekuly)
Uspořádání UspořádáníUspořádání
HPLC
Uspořádání
GC
Elektroforéza - dělení na základě pohyblivosti nabitého analytu
nebo micel v elektrickém poli (CZE, MEKC)p ( , )
vhodné pro látky s nábojem
např. pro organické kys., nukleotidy,
měření obsahu látek v malém objemuj
Separacep
Mobilní fáze • plynp y
• kapalina
• gradient vs isokratika
Stacionární fáze • Náboj – ionex
• Hydrofobicita – reverzní fáze normální fáze• Hydrofobicita – reverzní fáze, normální fáze,
HILIC
• Biospecifická afinita – afinitní kolona
• Velikost a tvar molekuly – gelová kolona
tR retenční čas látky zdržující se v systému
y g
(sephadex, sepharoza)
tM retenční čas látky, která se pohybuje spolu s MF
FM objem mobilní fáze za čas
VM mrtvý objem (FM*tM)VM mrtvý objem (FM tM)
LC - separaceLC separace
Princip kapalinové chromatografie:
http://chemwiki.ucdavis.edu
LC - separaceLC separace
Stacionární fáze
- podobné principy s SPE- podobné principy s SPE
- U chromatografie je materiál homogenní, malé částice
- Opakované použití (vs SPE – single use only)
Ionex:
kationt-aniont exchange; eluce zvýšení
iontové síly, změna pH
Reverzní fáze:
hydrofobní povrch; eluce zvýšením
hydrofobicity, nejvyužívanější stacionární fáze
LC - separaceLC separace
Afi it í k l G l á k lHILIC NP k l Afinitní kolona:
Specifický povrch;
biochemické interakce,
eluce nízkým pH vyšší
Gelová kolona:
Nálň tvoří silikagel
nebo polymery, velké
molekuly obtečou
HILIC, NP kolona:
Hydrofilní polymery nebo
silikagel s různými
polymery eluce zvýšeným eluce nízkým pH, vyšší
koncentrace soli, často v
sérii s další kolonou
molekuly obtečou,
malé se zdrží difúzí v
pórech.
polymery, eluce zvýšeným
podílem vody (př. analytu
AK, sacharidy)
LC - separaceLC separace
Využití více kolon:
Například 2D - LC uspořádání
iontově výměnné a reverzní fáze
Chirální kolona:
Separuje enantiomery, využití
například ve farmakologii ý
(využití např. v proteomice)
p g
GC – separaceGC separace
MF i t í l N A H CO i k tik (k t t l t l )MF: inertní plyn, N2, Ar, He, CO2, isokratika (konst. teplota plynu),
gradient (teplotní gradient)
SF: kolonky (Al, Cu, Ni, sklo), 1-5 m s adsorbenty (silikagel,
alumina, active carbon)
Analyt: těkavá a teplotně stabilní látka, často nutná derivatizace,
nízký limit detekce
Ve spojení s MS v posledních letech velmi využívaná v
metabolomice
 k ih h t t í h kt knihovny hmotnostních spekter
(u LC – různá spektra za různých podmínek: tvorba knihoven omezená)
Analyzátory - DetektoryAnalyzátory Detektory
• fotometrický detektorý
– absorpce fotonů chromoforem (metabolity s dvojitými vazbami,
aromatické sloučeniny, některé heteroatomy)
• fluorescenční detektor
– emise fotonů z excitovaných molekul“ (PAH a jejich derivátyemise fotonů z „excitovaných molekul (PAH a jejich deriváty,
nebo metabolity po konjugaci – vnesení fluoroforu)
l k h i ký d k• elektrochemický detektor
– změna elektrické veličiny po elektrochemické reakci látky v cele
detektoru s elektrodami (látky lehce oxidovatelné redukovatelnédetektoru s elektrodami (látky lehce oxidovatelné, redukovatelné,
fenoly, aromatické aminy, peroxidy, merkaptany, ketony,
aldehydy, konjugované nitrily, aromatické halogenované
sloučeniny)sloučeniny)
Analyzátory – Detektory – Hmotnostní detekceAnalyzátory Detektory Hmotnostní detekce
Analyzátory – Detektory – Hmotnostní detekce
Vznik iontů (zdroje iontů) Analyzátory
Analyzátory Detektory Hmotnostní detekce
PI fotoionizace
EI elektronová ionizace - malé
nepolarní molekuly spojení s GC
TOF
napětí urychluje ionty, m/z malé, t krátký, vhodné pro
analýzy směsí, ve spojení s MALDI identifikace
proteinů, vysokorozlišovacínepolarní molekuly, spojení s GC
ESI elektrosprej – spojení s CE, LC
DESI desorpce elektrosprejem
proteinů, vysokorozlišovací
OrbiTrap
ionty oscilují v elektrostatickém poli a vytváří
zaznamenatelný proud úměrný jejich m/z,DESI desorpce elektrosprejem
APCI chemická ionizace
APPI fotoionizace UV zářením ý
p ý j j ,
vysokorozlišovací
Kvadrupoly
změna radiofrekvenčního pole na elektrodách vytváří
hydrofobni latky – steroidy
MALDI desorpce a ionizace laserem
za nebo bez účasti matrice
filtr pro dané m/z, ty se dělí v prostoru, omezený
hmotnostní rozsah
Lineární a sférické iontové pasti
d b k d l i k á
Principy MS analyzátorů - separace iontů dle jejich doby letu, zakřivení dráhy letu, oscilací,
frekvencí cyklického pohybu a to v elektrických elektromagnetických a nebo magnetických
za nebo bez účasti matrice podoba s kvadrupoly, ionty zakoncentrovány
a izolovány v čase
frekvencí cyklického pohybu a to v elektrických, elektromagnetických a nebo magnetických
polích
 konečná detekce – řada principů (měření hodnoty iontového proudu, detekce emitovaných
částic-scintilace, elektronové násobiče, fotonásobiče), softwarové zpracování  vyhodnocení
Analyzátory – detektoryAnalyzátory detektory
NMR - Nukleární magnetická
resonance
FTICR – Iontová cyklotronová
rezonance s Fourierovou transformacíresonance
Zlatý standard 1H-NMR
sleduje odezvy jader s nenulovým magnetickým
momentem v silném magnetickém poli a jejich
interakci s vysokofrekvenčním
rezonance s Fourierovou transformací
ionty v cele v silném magnetickém poli se
pohybují v cyklech s frekvencí úměrnou jejich
interakci s vysokofrekvenčním
elektromagnetickým vlněním
nedestruktivní technika • minimální příprava
vzorku před analýzou• snadná identifikace
m/z, záznam frekvence se převádí FR na
hmotnostní spektrum
ultracitlivá MS • spektra s nejvyšším rozlišením ap ý
neznámých sloučenin • možnost měření in vivo
• kvantifikovatelná • nevyžaduje derivatizaci
vyšší požadavky na množství vzorku • nízká
citlivost
přesností • identifikace tisícovek metabolitů bez
předchozí separace
nárok na prostor a vakuum • vysoká cena
Analyzátory
MSI – hmotnostně spektrometrické zobrazování
zobrazovací techniky
(Farmacie, medicína, hledání biomarkerů, objasnění biochemických pochodů)
Zobrazovací techniky detekce Info o molekuláchZobrazovací techniky detekce Info o molekulách
(Optická mikroskopie) (procházející
“viditelné” záření)
(barvení: chemické
reakce např. s proteiny
...)...)
Elektronová mikroskopie elektronů Jen prvková analýza
Rentgenová spektroskopie rentgen. záření Jen prvková analýza
Autoradiografie fotonů (IR) Funkční skupiny
Pozitronová emisní tomografie -záření Značené molekuly
fotonů (UV VIS) Značené molekulyFluorescenční mikroskopie fotonů (UV, VIS) Značené molekuly
Hmotnostní spektrometrie (MALDI, DESI-MSI) (an)organické ionty Ano
Fujimura, Y., Miura, D. Metabolites 2014, 4(2), 319-346
MSIMSI
Fujimura, Y., Miura, D. Metabolites 2014, 4(2), 319-346
Imunoanalýza (immunoassays)Imunoanalýza (immunoassays)
Reakce antigenu s protilátkou, kdy enzymově značené (ALP, HRP) nebog p , y y ( , )
radioaktivně značené (125 I) antigeny nebo protilátky se měří pomocí
fluorescence/absorbance/chemiluminiscence po reakci dodaného substrátu s
enzymem (nebo v případě radioaktivního značení měřením scintilace) .
Analyt:
steroidy, hormony, (glyko)lipidy, peptidy, sekundární metabolity
P tilátk l kl ál íProtilátky polyklonální:
po imunizaci zvířete, protilátky proti různým epitopům, silná afinita
Protilátky monoklonální:y
produkce buněčnými liniemi, proti jednomu epitopu, možná krosreaktivita
Kompetitivní EIA RIAKompetitivní EIA, RIA
(enzyme) radioimmunoassay
Imunoanalýza (immunoassays)
ELISA
Imunoanalýza (immunoassays)
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
Praktické poznámky, validace
Výběr vhodného blanku:
K t l í k či tá d b t fi iál í tkáň ( d či té“ l k lit )Kontrolní vzorek: čistá voda nebo arteficiální „tkáň (voda z „čisté“ lokality),
rozpouštědlo (zjištění kontaminace během procesu), instrumentální blank
(chování vzorku během analýzy, opakované měření mezi vzorky)
Výběr vhodné metody extrakce a analýzy:
Selektivita: schopnost nalézt a kvantifikovat analyt v matrici
Accuracy a Precision: měření známé koncentrace analytu v replikátu
Spike recovery: zjištění změny známé koncentrace analytu (surrogate
standard) způsobené procesem extrakce, analýzy
Kvantifikace:
Vhodná detekce (MS, DAD, ECD)( )
Kalibrace: interní, externí standard v čisté matrici nebo rozpouštědle
Snížení vlivu matrice: nízký nástřik, přítomný interní standard, standardní
přídavek
Příklady stanovení metabolitů
(př – peptidy a lipidy)(př. peptidy a lipidy)
Analýza metabolitů – thioly (příklad)Analýza metabolitů thioly (příklad)
Stanovení thiolu
Stanovení GSH/GSSG (cytosol) a CyS/CySS (plasma), antioxidanty, chrání
peptid před oxidací vratným navázáním na cystein
• Homogenizace-redukce S=S z peptidu (DTT)-srážení proteinů kyselinou-• Homogenizace-redukce S=S z peptidu (DTT)-srážení proteinů kyselinoukonjugace-SH
skupiny (NEM, DTNB, DansylCl, IAA)- chromatografie-MS,
spektrofotometrie, fluorometrie, elektrochemická detekce
ELISA• ELISA
• Příklad stanovení volného GSH a GSSG ve tkáni
Modelový příklad – výzkumná studie
Vliv nanončástic Cd po respirační expozici u myší
– Expozice v izolovaných klecích 13 týdnů
– 5x Kontroly (K), dvě rostoucí “dávky” NPs (5x D1, 5x D2)
– Vyhodncení fyziologických a toxikologických parametrů
• Jedním z analytů – GSH / GSSG
Bláhová (2014)
Anal Bioanal Chem 406:5867–5876
Modelový příklad – výzkumná studie
1. Ukončení experimentu: na co dát pozor?
• VZORKOVÁNÍ
– Organizace odběrů
• 3 skupiny, zpracovávat “současně” (ne nejprve “K”, pak D1…)
– Typ orgánů-tkání pro analýzu
• Respirační cesta  primárně plíce, pak ostatní orgány
Rychlost zpracování– Rychlost zpracování
• Velká rychlost nutná ! Malé molekuly - rychlý turnover
– Celý orgán ihned do tekutého dusíku
– Udržování a transport
• Stále v mraženém stavu
Bláhová (2014)
Anal Bioanal Chem 406:5867–5876
Modelový příklad – výzkumná studie
Zpracování vzorku – na co dát pozor ?
• HOMOGENIZACE
– Odběr části (alikvotu)
• zmrzlá tkáň plic
• vážení – hmotnost - orgánu
– Přidání homogenizačního roztoku
• Kontrola pH – vodný pufr (GSH-GSSG dobře rozpustné ve vodě)
• Teplota – chlazený (!)
– Homogenizace
• Např. skleněné kuličky, vysokorychlostní třepání
• Stálé chlazení, 2x 20s
Bláhová (2014)
Anal Bioanal Chem 406:5867–5876
Modelový příklad – výzkumná studie
• Další úpravy vzorku– na co dát pozor ?
• Další kroky• Další kroky
– Vhodné pH
• Zajištěno alkalickým pufrem
(použit již pro extrakci)
V jednom kroku– V jednom kroku
• Přidání INTERNÍ STANDARD (13C 15N glutathione)
• Přidání konjugačního činidla: blokování reaktivních –SH skupin
(DTNB)
• Inkubace konjugace (při T-lab)Inkubace konjugace (při T lab)
– Vysrážení proteinů (znovu chlazení)
• Přidání SSA (kys. sulfosalycilová)
• Inkubace - srážení
Centrifugace (chlazení)  supernatant– Centrifugace (chlazení)  supernatant
– Ředění mobilní fází LC (chlazení)
 snížení “velmi vysoké” koncentrace
( ké k t i ři lé áž )(vysoké koncentrace i při malé navážce)
 menší vliv matrice v analýze
– Zamražení -80°C – uchování k analýze
Bláhová (2014)
Anal Bioanal Chem 406:5867–5876
Modelový příklad – výzkumná studie
Analýza
• Důležité body
– Typ separace – LC
– Výběr kolony
• Modifikovaná C18 (analyty jsou polární)Modifikovaná C18 (analyty jsou polární)
– Detekce
• Možná např. Elektrochemická (reakce na -SH)
M ž á i UV VIS (d t k k j át GSH DTNB ! GSSG)• Možná i UV-VIS (detekce konjugátu GSH-DTNB, ne! GSSG)
• Využita hmotnostní detekce
– Vlastní analýzaý
• Detekce GSH-DTNB, 13C-15N-GSH-DTNB, GSSG
– Vyhodnocení  koncentrace v tkáních
Bláhová (2014)
Anal Bioanal Chem 406:5867–5876
Modelový příklad – výzkumná studie
Vyhodnocení
Fig. 6 Content of GSH (a),
content of GSSG (b), and GSH/
GSSG ratio (c) in lung of mice
after chronic exposure (1–13
weeks) to CdO nanoparticles at
dose 1 (D1) and dose 2 (D2).
Numbers with asterisk (*) in the
graph indicate significant
differences compared to thedifferences compared to the
control variant within the
respective week (p<0.05; N=5
animals)
Bláhová (2014)
Anal Bioanal Chem 406:5867–5876
Analýza metabolitů – lipidyAnalýza metabolitů lipidy
Analýza metabolitů – lipidyAnalýza metabolitů lipidy
Extrakce: různá pro různě polární lipidy, aditiva podporující rozpustnost,p p p y p p j p
antioxidanty, práce ve skle, N2, -80°C, využití interních standardů
Analýza: „Shotgun“ MS (bez separace), UHPLC MS, SFC MS
Extrakt, tkáň
D t il i d lší í k
Bioinformatika (korekce dat, analýza
dat-PCA, visualizace, interpretace)
Detail – viz další snímek
Shrnutí
• Student(ka) by měl(a) znát
– Co jsou to metabolity? Jaké existují typy aj y j ypy
skupiny?
– Jaké jsou klíčové kroky v jejich analýze?Jaké jsou klíčové kroky v jejich analýze?
Principy metod separace a detekce
U vybrané látky navrhnout a diskutovat– U vybrané látky navrhnout a diskutovat
přístup k analýze z biologického vzorku