Mgr. Šárka Bidmanová, Ph.D. Loschmidtovy laboratoře, Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita 77580@mail.muni.cz 1. Úvod do studia mikrobiologie 2. Archea 3. Bakterie 4. Fyziologie růstu bakteriální populace 5. Výživa a metabolismus bakterií 6. Metabolismus bakterií I 7. Metabolismus bakterií II 8. Genetika bakterií 9. Nejvýznamnější zástupci bakterií a jejich význam 10.Sinice 11.Kvasinky 12.Vláknité houby 13.Viry a priony Opakování – metabolismus bakterií I • Při katabolických reakcích dochází k rozkladu složitějších látek na jednodušší. ○ Správně ○ Špatně • NADH slouží v bakteriální buňce jako univerzální přenašeč energie. ○ Správně ○ Špatně • Výsledkem glykolýzy je tvorba CO2, H2O a zisk energie ve formě ATP. ○ Správně ○ Špatně • Fermentace je uskutečňována chemolitotrofními bakteriemi za striktně anaerobních podmínek. ○ Správně ○ Špatně • Aerobní respirace je proces oxidace organického substrátu molekulárním kyslíkem. ○ Správně ○ Špatně Opakování – metabolismus bakterií I • Úplná oxidace glukosy při aerobní respiraci vede k tvorbě 2 ATP. ○ Správně ○ Špatně • Kyselina pyrohroznová vstupuje do Krebsova cyklu a slučuje se s kyselinou oxaloctovou. ○ Správně ○ Špatně • Chemolitotrofní bakterie získávají energii oxidací jednoduché organické látky. ○ Správně ○ Špatně • Konečným akceptorem elektronů a H+ při anaerobní respiraci jsou anorganické molekuly. ○ Správně ○ Špatně • Fototrofní bakterie získávají ATP fotosyntézou za současné produkce O2. ○ Správně ○ Špatně 1. Úvod do studia mikrobiologie 2. Archea 3. Bakterie 4. Fyziologie růstu bakteriální populace 5. Výživa a metabolismus bakterií 6. Metabolismus bakterií I 7. Metabolismus bakterií II 8. Genetika bakterií 9. Nejvýznamnější zástupci bakterií a jejich význam 10.Sinice 11.Kvasinky 12.Vláknité houby 13.Viry a priony Metabolismus Uvolnění tepla Uvolnění tepla Katabolické reakce: přenos energie ze složitých molekul na ATP Anabolické reakce: přenos energie z ATP na složité molekuly Složité molekuly: polysacharidy, proteiny, lipidy Jednoduché molekuly: glukosa, aminokyseliny, glycerol, karboxylové kyseliny Anabolismus Buňka Buněčné struktury Supramolekulové komplexy Makromolekuly Anorganické molekuly CO2, NH3, H2O, PO4 3Nukleotidy, aminokyseliny, sacharidy, karboxylové kyseliny Stavební jednotky Nukleové kyseliny, proteiny, polysacharidy, lipidy Membrány, enzymové komplexy Ribosomy, bičíky Prekurzory Kyselina pyrohroznová, acetyl-koA, glukosa-6-fosfát, kyselina α-ketoglutarová Anabolismus – asimilace uhlíku • Autotrofní bakterie - Jediný zdroj uhlíku – fixace CO2 - Calvinův cyklus - 6 CO2 + 18 ATP + 12 NADPH + 12 H+ + 12 H2O glukosa + 18 ADP + 18 Pi + 12 NADP+ - Reduktivní cyklus trikarbonových kyselin - 2 ferredoxinred + CO2 + CH3COS-koA CH3COCOOH + HS-koA + ferredoxinox - Fotolitotrofní bakterie – zisk energie ze slunečního záření - Chemolitotrofní bakterie – zisk energie oxidací anorganické látky Anabolismus – fixace CO2 autotrofy • Calvinův cyklus Fixace CO2 Uvolnění glycer- aldehyd-3-fosfátu Regenerace ribuloso-1,5- bisfosfátu Redukce Rubisco 6 12 6 6 6 12 12 12 12 12 10 2 Glukosa a další sloučeniny 3-PGA kyselina 3-fosfoglycerová G3P glyceraldehyd-3-fosfát RuBP ribuloso-1,5-bisfosfát Anabolismus – fixace CO2 autotrofy • Reduktivní cyklus trikarbonových kyselin 2 Fdred acetyl-koA K. citronová K. isocitronová K. α-ketoglutarová Sukcinyl-koA K. oxaloctová K. jablečná K. fumarová K. jantarová K. pyrohroznová 2 Fdred CoA NAD(P)H Anabolismus – asimilace uhlíku • Heterotrofní bakterie - Zdroj uhlíku – organické látky - Fixace CO2 – doplňování intermediátů Krebsova cyklu - Kyselina fosfoenolpyrohroznová + CO2 kyselina oxaloctová + Pi - Kyselina pyrohroznová + CO2 + ATP kyselina oxaloctová + ADP + Pi - Kyselina pyrohroznová + CO2 + NADH + H+ kyselina jablečná + NAD+ Anabolismus - asimilace dusíku NH4 + NH4 + NO3 - N2 glutamát glutamin glutamát 2-oxoglutarát aminokyseliny pyruvát 2-oxoglutarát glutamát aminokyseliny alanin aminokyseliny + 2 H+ + 2 H+ + 2 H+ ADP ATP redukce Anabolismus – asimilace dusíku • Fixace molekulového dusíku – redukce N2 na amoniak • Enzymy – nitrogenasa + hydrogenasa • Donor H+ a elektronů – organický substrát Nitrogenasa Anabolismus – asimilace dusíku • Fixace molekulového dusíku – symbiotické i volné bakterie Atmosféra Půda Bakterie fixující dusík Organická hmota (humus) Amonifikační bakterie Denitrifikační bakterie Kořen Transport nitrátů a dusíkatých org. sloučenin xylémem N03 - (nitrát) bakterie Nitrifikační H+ (z půdy) N2 N2 NH3 (amoniak) NH4 + (amonné ionty) NH4 + Anabolismus – asimilace dusíku • Fixace molekulového dusíku – symbiotické bakterie Kořenové vlášení Rhizobium Infekční vlákno Bakteroid Vakuola Hlízka Anabolismus – asimilace síry • Redukce síranů SO4 2Adenosin 5'-fosfosulfát Fosfoadenosin 5'-fosfosulfát SO3 2- H2S Organické sirné sloučeniny (např. cystein) NADPH + H+ Fosfoadenosin 5‘-fosfát, NADP+ NADP+ NADPH + H+ ATP ADP ATP PPi Anabolismus – biosyntéza sacharidů • Glukoneogeneze – u většiny bakterií Glukosa Glukosa-6-fosfát Fruktosa-6-fosfát Glyceraldehyd-3-fosfát Dihydroxyaceton fosfát 1,3-bisfosfoglycerát 3-fosfoglycerát 2-fosfoglycerát Fosfoenolpyruvát Oxalacetát Pyruvát Krebsův cyklus Pentosový cyklus ATP ADP ATP ADP ADP ATP ADP ATP ADP ATP Fruktosa-1,6-bisfosfát Anabolismus – biosyntéza polysacharidů • Biosyntéza glykogenu - ATP + glukosa-1-fosfát ADP-glukosa + PPi - (Glukosa)n + ADP-glukosa (glukosa)n+1 + ADP Glykolýza Glukosa Glukosa- 6- fosfát Fruktosa- 6- fosfát Pyruvát Glykogen (u bakterií) Glykogen (u živočichů) Peptidoglykan (u bakterií) Anabolismus – biosyntéza peptidoglykanu Přenašeč Pentapeptid Peptidoglykan Rostoucí buněčná stěna Cytoplasmatická membrána Cytoplasma Anabolismus – biosyntéza peptidoglykanu • Transpeptidace NAG - N-acetylglukosamin NAM – kyselina N-acetylmuramová Anabolismus – biosyntéza lipidů • Zahrnuje tvorbu glycerolu a karboxylových kyselin Glukosa Glykolýza Pyruvát Acetyl-koA Dihydroxyaceton fosfát Glyceraldehyd- 3-fosfát Glycerol Lipid Karboxyl. kyselina Krebsův cyklus Anabolismus – biosyntéza lipidů • Syntéza karboxylových kyselin - 1 acetyl-koA – karboxylace za účasti ATP – vznik malonyl-koA - 2. acetyl-koA – reakce s acyl přenášejícím proteinem (ACP) Anabolismus – biosyntéza aminokyselin Aminokyseliny Pentosový cyklus Entner- Doudoroffova dráha Acetyl-koA Krebsův cyklus Aminace nebo transaminace Anabolismus – biosyntéza aminokyselin Kyselina glutamová Kyselina oxaloctová Kyselina asparagová Kyselina α-ketoglutarová Transaminace Kyselina pyrohroznová Acetyl-koA Kyselina citronová Karboxylové kyseliny, steroly Kyselina α-ketoglutarováSukcinyl- koA Kyselina oxaloctová Kyselina asparagová Další aminokyseliny, puriny, pyrimidiny Další aminokyseliny Puriny Kyselina glutamová Hem, bakteriochlorofyl Anabolismus – biosyntéza nukleotidů Krebsův cyklus Acetyl-koA Glukosa Glykolýza Glukosa-6-fosfát Kyselina fosfoglycerová Pyruvát Glycin Purinové nukleotidy Pyrimidinové nukleotidy Pentosa (5-C sacharid) Glutamin Kyselina asparagová Pentosová dráha nebo EntnerDoudoroffova dráha Anabolismus – biosyntéza DNA • Replikace chromosomální a plasmidové DNA • Replikace = tvorba kopií DNA zajišťující přenos genetické informace Rodičovská dsDNA Počátek replikace ori Replikace Terminátor replikace Anabolismus – biosyntéza DNA • Replikace probíhá semikonzervativně a semidiskontinuálně • 3 kroky: iniciace, elongace, terminace replikace • Iniciace replikace – navázání replikačních proteinů na počátek replikace • Stavební jednotky – nukleosid-5-trifosfáty • Enzymy - DNA-polymerasa – syntéza vlákna DNA ve směru 5' → 3' - DNA-ligasa - DNA-primasa - DNA-helikasa Anabolismus – biosyntéza DNA Rodičovská DNA Okazakiho fragmenty Vedoucí řetězec Opožďující se řetězec DNA polymerasa DNA ligasa Templát Templát Směr replikace Opožďující se řetězec Vedoucí řetězec Anabolismus – biosyntéza RNA • Enzym – RNA polymerasa • Primární transkript - mRNA - pre-rRNA - pre-tRNA • Transkripční jednotky bakterií - Operony - Neoperonové transkripční jednotky Regulační gen Promotor Strukturní genyOperátor Represor Když se represor naváže na operátor, neprobíhá transkripce DNA Terminátor Anabolismus – biosyntéza RNA • Průběh transkripce - Pohyb RNA-polymerasy ve směru od 3'-konce k 5'-konci negativního DNA řetězce Elongace RNA polymerasa Pozitivní řetězec DNA RNA nukleotidy Směr transkripce Negativní řetězec DNA Nově vytvořená RNA 3'-konec Anabolismus – biosyntéza RNA • Bakteriální mRNA - Přepis Shineovy-Dalgarnovy sekvence – vazba na ribosomy - Přepis strukturních genů – překlad do primární struktury proteinu - Polygenní - Bez posttranskripčních úprav Polygenní mRNA Monogenní mRNA Prokaryontní mRNA Kódující sekvence Nekódující sekvence Kódující sekvence Nekódující sekvence Protein A Protein B Protein C Protein Eukaryontní mRNA 5‘-čepička 5‘ 3‘ 3‘5‘ Anabolismus – biosyntéza bílkovin • Translace mRNA na ribosomech • Řetězec bílkoviny bezprostředně po uvolnění z ribosomu zaujímá sekundární strukturu, pak tvorba terciární struktury • Stavební jednotky – 20 standardních aminokyselin + selenocystein • Vazba aminokyselin na tRNA – pomocí aminoacyl-tRNA-syntetas Akceptorové rameno Antikodon Vodíkové vazby Anabolismus – biosyntéza bílkovin • Vazebná místa na ribosomu Malá podjednotka (30S) Velká podjednotka (50S) P-místo mRNA Anabolismus – biosyntéza bílkovin • Iniciace - Navázání mRNA na malou podjednotku ribosomu - Iniciační kodon AUG – vazba fMet~tRNAi fMet - Připojení malé podjednotky ribosomu k velké • Elongace - Vstup aminoacyl-tRNA do A-místa - Přesun do P-místa, tvorba peptidové vazby a prodloužení polypeptidového řetězce - Vytěsnění původní peptidyl-tRNA do E-místa - Translokace ribosomu • Terminace - V přítomnosti terminačních kodonů UAA, UAG nebo UGA mRNA Vytěsnění předchozí tRNA Aminoacyl-tRNA Prodloužení polypeptidového řetězce o 1 aminokyselinu Polypeptidový řetězec Regulace metabolismu • Regulace syntézy enzymů - Optimální poměr mezi rychlostí syntézy enzymů a rychlostí syntézy celkové buněčné bílkoviny • Regulace na úrovni aktivity enzymu - Pouze u klíčových enzymů metabolismu Regulace metabolismu • Regulace syntézy enzymů - Konstitutivní enzymy – syntéza nezávisle na podmínkách prostředí - Indukovatelné enzymy – syntéza pouze pokud je substrát přítomen v prostředí Substrát Meziprodukt Indukce s a b c d A B C D Regulace metabolismu • Regulace syntézy enzymů – laktosový operon Transkripce Transkripce RNA polymerasaRepresorový protein Allolaktosa CAP s navázaným cAMP V prostředí bez laktosy V prostředí s laktosou a glukosou V prostředí s laktosou bez glukosy Regulace metabolismu • Regulace syntézy enzymů – laktosový operon Transkripce RNA polymerasa Represorový protein Allolaktosa CAP s navázaným cAMP V prostředí bez laktosy V prostředí s laktosou a glukosou V prostředí s laktosou bez glukosy Transkripce Regulace metabolismu • Regulace syntézy enzymů - Represe – regulace anabolismu, enzymy nejsou syntetizovány, pokud je výsledný produkt této dráhy přítomen v prostředí - Represe konečným produktem – enzym nezbytný pro syntézu základní struktury buňky – nepřetržitá syntéza, ale syntéza může být zpomalena - Katabolická represe – v přítomnosti 2 substrátů upřednostnění energeticky výhodnějšího Konečný produktMeziprodukt srpoi Represe O P R S Regulace metabolismu • Regulace na úrovni aktivity enzymu - Pozitivní efektor – zvýšení katalytické aktivity - Negativní efektor – snížení katalytické aktivity - Inhibice konečným produktem – snížení aktivity prvního enzymu Konečný produktMeziprodukt srpoi Inhibice konečným produktem O P R S Shrnutí - anabolismus Asimilace C Asimilace N Asimilace P Syntéza polysacharidů Syntéza purinových a pyrimidinových bází Syntéza aminokyselin Syntéza karboxylových kyselin Syntéza glycerolu Syntéza monosacharidů Syntéza lipidů Syntéza bílkovin Syntéza nukleových kyselin Reference • Franche C., Lindström K., Elmerich C. (2009): Nitrogen-fixing bacteria associated with leguminous and non-leguminous plants. Plant Soil 321: 35-59. • Görke B., Stülke J. (2008): Carbon catabolite repression in bacteria: many ways to make the most out of nutrients. Nature Reviews Microbiology 6: 613-624. • Němec M., Horáková D., Základy mikrobiologie pro učitelské studium, Masarykova univerzita, Fakulta přírodovědecká, Brno, 2002. • Rosypal S., Nový přehled biologie, Scientia, Praha, 2003. • Rosypal S. a kol., Obecná bakteriologie, SPN, Praha, 1981. • Talaro K.P., Foundations in microbiology (6th edition), McGraw-Hill, New York, 2008. • Typas A., Banzhaf M., Gross C.A., Vollmer W. (2012): From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews Microbiology 10: 123-136. • Willey J., Sherwood L., Woolverton C., Prescott´s principles of microbiology, McGraw-Hill, New York, 2009. Animace • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0070960526/student_view0/chapter5/animation_quiz_1.html • http://glencoe.mcgraw- hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::640::480::/sites/dl/free/0003292010/811350/Root _Nodule_Formation.swf::Root%20Nodule%20Formation • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/007337525x/student_view0/exercise9/peptidoglycan_synthesis.html • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/007337525x/student_view0/exercise17/structural_basis_of_dna_replication. html • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/007337525x/student_view0/exercise17/mrna_synthesis__transcription_.html • http://highered.mcgraw-hill.com//sites/dl/free/0072437316/120077/micro06.swf • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/007337525x/student_view0/exercise24/combination_of_switches__the_lac_ operon.html • http://www.professorcrista.com/files/animations/posted_animations/operons_repression.ht ml