Mgr. Šárka Bidmanová, Ph.D. Loschmidtovy laboratoře, Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita 77580@mail.muni.cz 1. Úvod do studia mikrobiologie 2. Archea 3. Bakterie 4. Fyziologie růstu bakteriální populace 5. Výživa a metabolismus bakterií 6. Metabolismus bakterií I 7. Metabolismus bakterií II 8. Genetika bakterií 9. Nejvýznamnější zástupci bakterií a jejich význam 10.Sinice 11.Kvasinky 12.Vláknité houby 13.Viry a priony Opakování – genetika bakterií • Gen je úsek DNA, který kóduje polypeptid, tRNA nebo rRNA. ○ Správně ○ Špatně • Genom bakterií je tvořen chromosomovou, plasmidovou a mitochondriální DNA. ○ Správně ○ Špatně • Posunová mutace je vyvolána záměnou nukleotidů. ○ Správně ○ Špatně • UV záření poškozuje DNA tvorbou dimerů cytosinu. ○ Správně ○ Špatně • Amesův test slouží k izolaci mutantů rezistentních k antibiotikům. ○ Správně ○ Špatně Opakování – genetika bakterií • Rekombinace je výměna sekvencí nukleotidů mezi homologními úseky DNA. ○ Správně ○ Špatně • Horizontální přenos genů je přenos genů z rodičů na potomstvo. ○ Správně ○ Špatně • Konjugace je přenos bakteriální DNA z buňky donora do buňky recipienta prostřednictvím bakteriofága. ○ Správně ○ Špatně • R plasmidy nesou geny pro reprodukci bakteriální buňky. ○ Správně ○ Špatně • Stanovení sekvence DNA umožňuje Sangerovo sekvencování. ○ Správně ○ Špatně 1. Úvod do studia mikrobiologie 2. Archea 3. Bakterie 4. Fyziologie růstu bakteriální populace 5. Výživa a metabolismus bakterií 6. Metabolismus bakterií I 7. Metabolismus bakterií II 8. Genetika bakterií 9. Nejvýznamnější zástupci bakterií a jejich význam 10.Sinice 11.Kvasinky 12.Vláknité houby 13.Viry a priony Bakterie a jejich význam • Lékařská mikrobiologie - Přirozená mikroflóra - Původci onemocnění • Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie - Proteiny - Antibiotika, vitamíny, aminokyseliny - Geneticky modifikované organismy - Fermentované mléčné výrobky, párky, salámy, kysané zelí - Čištění odpadních vod, odstraňování odpadů, biologické loužení kovů z rud Lékařská mikrobiologie • Lékařská mikrobiologie - Studium vztahu mikroorganismů a člověka - Zaměřena zejména na mikroorganismy jako původce onemocnění • Normální mikroflóra - Mikroorganismy na různých místech těla, hostiteli více či méně prospěšné - Ochrana sliznice před osídlením patogenními mikroorganismy - Tvorba mikroprostředí, např. pH - Rozklad nestravitelných zbytků ve střevě - Tvorba vitamínů střevními bakteriemi Lékařská mikrobiologie – normální mikroflóra Staphylococcus, Corynebacterium, Haemophilus, Streptococcus Streptococcus, Neisseria, Haemophilus Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Corynebacterium Lactobacillus Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Peptostreptococcus, Enterobacteriaceae Bacteroides, Lactobacillus, Clostridium, Mycobacterium Streptococcus, Lactobacillus, Peptostreptococcus Nos Ústa Kůže Žaludek Tenké střevo Tlusté střevo Plíce KonečníkPochva Lactobacillus, Enterobacteriaceae Lékařská mikrobiologie – infekce • Patogen = původce onemocnění, organismus schopný vyvolat onemocnění u zdravého hostitele • Patogenita = schopnost vyvolat u hostitele onemocnění • Virulence = stupeň patogenity specifického mikroorganismu • Faktory virulence – usnadňují průnik patogena do hostitele, vyvolávají onemocnění a pomáhají patogenu uniknout před obrannými mechanismy hostitele, např. kapsula, fimbrie, produkce toxinů • Obranné mechanismy hostitele – ochrana organismu před patogenem, vrozená a adaptivní obrana Lékařská mikrobiologie – infekce • Průběh onemocnění - Latentní stádium – počátek působení patogena – první příznaky nemoci (inkubační doba) - Prodromální stádium – nespecifické příznaky, např. únava, bolest hlavy, nesoustředěnost, nechutenství, nespavost - Manifestní stádium – specifické i nespecifické příznaky - Rekonvalescence – zotavování, vymizení klinických příznaků - Ukončení nemoci – úplné uzdravení, neúplné uzdravení, přechod do chronicity, smrt v Lékařská mikrobiologie – infekce • Přenos onemocnění Zdroj Cesta Cílový organismus Přenašeč - Člověk - Zvíře Kontaminovaný předmět Přímý přenos - Kontakt - Kapénky - Perinatální Nepřímý přenos - Vzduch - Kontaminovaná voda, potraviny, půda - Vektor - Transplacentární Lékařská mikrobiologie – infekce • Infekce dýchacích cest - Nejběžnější infekce, většina virového původu Zánět nosních dutin, zánět středního ucha – Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae Angína – Streptococcus pyogenes Pablánový zánět hltanu a průdušnice – Corynebacterium diphteriae Plicní tuberkuloza – Mycobacterium tuberculosis Zánět plic – Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae Zánět průdušnice a průdušek – Mycoplasma pneumoniae Lékařská mikrobiologie – infekce • Infekce trávicí soustavy - Často přenos kontaminovanými potravinami a vodou Zubní kaz – nejčastější civilizační onemocnění – Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces Otrava z potravin – Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium botulinum Průjmové infekce – Campylobacter jejuni, Salmonella, Escherichia coli patogenní serotypy, Shigella, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae Lékařská mikrobiologie – infekce • Infekce močových cest - Bakterie čeledi Enterobacteriaceae, Escherichia, Enterococcus, Proteus, Staphylococcus, Mycoplasma Zánět ledvinné pánvičky Zánět močovodu Zánět močového měchýře Zánět močové trubice Lékařská mikrobiologie – infekce • Infekce pohlavních orgánů - Kapavka – Neisseria gonorrhoeae - Syfilis – Treponema pallidum - Urogenitální infekce – Chlamydia trachomatis • Infekce kůže a ran - Spála, erysipel (růže) – Streptococcus pyogenes - Povrchová poranění – Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Clostridium tetani - Hluboká poranění a zhmoždění – Clostridium perfringens, Clostridium septicum - Popáleninové infekce – Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes Lékařská mikrobiologie – infekce • Sepse - Systémové infekce postihující celý organismus - Příznaky – horečka, snížený tlak, zrychlený tep, porucha vědomí, někdy žloutenka - Staphylococcus, Escherichia, Enterococcus, Streptococcus • Infekce nervového systému - Hnisavé meningitidy – Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniaea - Borelióza – přenos klíšťaty – Borrelia burgdorferi Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Biotechnologie = jakékoli technologie, které využívají biologické systémy, živé organismy nebo jejich části k výrobě cílových produktů • Klasické biotechnologie - Založeny na empirii - Výroba potravin, např. pivo, chléb, sýry • Moderní biotechnologie - Zaváděny od 2. poloviny 20. století - Využití rozvoje mikrobiologie, molekulární biologie, procesního inženýrství, biochemie, analytické a fyzikální chemie - Využití genového inženýrství Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Fermentované mléčné výrobky - Kysaná mléka – Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris - Jogurty – Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus - Kefír – Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Fermentované mléčné výrobky – výroba jogurtů Čerstvé mléko Přidání přísad a promíchání PasterizaceHomogenizaceOchlazení Inokulace bakteriální kulturou Fermentace Ochlazení na 0-5 °C Přidání příchutí a ovocných složek Plnění a uchovávání v chladu Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Tvaroh a kyselé sýry - Vznik z mléka srážením bílkoviny kaseinu kyselinou mléčnou - Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Leuconostoc cremoris Výroba sýřeniny Krájení tvarohu Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Sladké sýry - Výroba sýřením ze sraženého mléka - Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Propionibacterium Sýry holandského typu Sýry švýcarského typu Sýry velmi tvrdé - gouda, eidam - ementál - parmezán Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Sladké sýry - výroba - Sýřením ze sraženého mléka Mechanické čištění mléka v odstředivkách Pasterizace Zrání sýrařského mléka prostřednictvím bakterií (Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Propionibacterium) Ukládání sýrového zrna do forem, oddělení syrovátky Solení k ochucení a konzervaci Zrání Srážení mléka působením proteolytických enzymů Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Výroba másla Odstřeďování mléka – vznik smetany Pasterizace smetany Fyzikální zrání Biologické zrání – přidání smetanového zákysu (Streptococcus, Leuconostoc) Stloukání Praní, hnětení, formování, balení Podmáslí Máslo Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie Fermentované potraviny Bakterie Káva Erwinia Kvašené okurky Pediococcus, Lactobacillus Kysané zelí Lactobacillus Olivy Leuconostoc, Lactobacillus Párky, salámy Pediococcus, Lactobacillus Sojová omáčka Lactobacillus Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Genové inženýrství - Techniky vedoucí k umělé tvorbě geneticky pozměněných buněk nebo celých organismů zásahem do jejich DNA - Geneticky modifikovaný organismus = genetický materiál změněn cílenou změnou, které nelze dosáhnout přirozeně – křížením, šlechtěním - Rekombinantní DNA = uměle připravená sekvence vzniklá kombinací různých sekvencí DNA - Rekombinantní protein = protein získaný vnesením rekombinantní DNA do hostitelského organismu Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Genové inženýrství - Klonování = tvorba identických kopií fragmentů DNA - Klonovací vektor = molekula, která zajišťuje přenos cizí DNA do hostitelské buňky a její klonování Počátek replikace ori Rezistence k ampicilinu Lac operon pUC19 ampR lacZ HindIII EcoRI BamHI ori Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • PCR (polymerasová řetězová reakce) - Amplifikace úseku DNA - Využití: amplifikace genu pro klonování, sekvenování, vnášení cílených mutací do genu, identifikace mikroorganismů - Reakční směs: matricová DNA, DNA polymerasa, směs nukleotidů, primery - PCR cyklus: denaturace DNA, přisednutí primerů na kopírovanou DNA, syntéza dvou vláken DNA s využitím primerů Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • PCR (polymerasová řetězová reakce) PrvnícyklusDruhýcyklus DNA polymerasa Primer Cílová DNA Denaturace DNA – inkubace DNA při 94 °C (1 min) Přidání primerů, nukleotidů a DNA polymerasy Přisednutí primerů na jednořetězcovou DNA při 60°C (1 min) Syntéza 2 kopií DNA podle matrice při 72 °C (1 min) Opakování cyklu Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Genové inženýrství Plasmidová DNA Restrikční místa Štěpení Štěpení Štěpení Štěpení Štěpení plasmidové DNA restrikčním enzymem Vznik fragmentu DNA Štěpení cílové DNA pomocí stejného restrikčního enzymu Propojení obou fragmentů DNA díky párování bazí Vznik kruhovité molekuly DNA po spojení fragmentů Spojení obou fragmentů pomocí DNA ligasy, vznik rekombinantní DNA Rekombinantní DNA Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie – genové inženýrství Izolace plasmidu Tvorba rekombinantní DNA Transformovaná bakterie Cílový gen Štěpení DNA Plasmid RNA Protein Produkce enzymů – např. amylasy, celulasy a další s průmyslovým využitím Produkce proteinů – např. růstový faktor s využitím v medicíně Geneticky modifikované rostliny – odolnost proti škůdcům Geneticky modifikované bakterie – degradace toxických látek Plasmid Bakteriální chromosom Produkce cílového proteinuVyužití geneticky modifikovaných organismů Bakteriální buňka Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Produkce proteinů fermentačními procesy Fermentace Intracelulární enzymy Extracelulární enzymy Filtrace, zakoncentrování Purifikace Narušení buněčné stěny Separace buněk Sušení Přídavek stabilizujících látek Práškový enzym Roztok enzymu Sušící komora Roztok enzymu Přívod plynu Práškový produkt Odvod plynu Bakteriální inokulum Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Produkce proteinů fermentačními procesy – fermentor Kultivační médium Míchání Přívod chladící vody Přívod vzduchu Odvod antibiotika Chlazení Odvod plynů Přívod kyseliny/zásady pro udržení pH Přívod páry při sterilizaci Motor Odstranění pěny Míchadlo Odvod produktů Plášť Produkce proteinu Čas Početbuněk Bakteriální buňky Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie – produkce enzymů – produkce enzymůOblast Enzymy Aplikace Detergenty Lipasa, proteasa Prací a čistící prostředky Textilní a kožedělný průmysl Proteasa, amylasa Změkčování kůží, barvení denimových látek, modifikace povrchu látek Potravinářský průmysl Amylasa, chymosin, invertasa, β-galaktosidasa, laktasa, pektinasa Chléb, pečivo, cukrovinky, výroba piva, mléčných výrobků, zpracování ovocných šťáv Papírenský průmysl Odpadové hospodářství Celulasa, xylanasa Bělení papíru, zpracování dřevěných odpadů Zemědělství Xylanasa, proteasa, fytasa Krmiva Medicína Farmaceutický průmysl Glukosaoxidasa, peroxidasa, lipasa Diagnostika, syntéza opticky čistých látek, antibiotik Molekulární biologie Restriktasy, DNA polymerasy a ligasy PCR, genové inženýrství Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Produkce antibiotik - Látky produkované organismy nebo synteticky (případně semisynteticky) - Streptomyces – streptomycin, chloramfenikol - Bacillus – polymyxin, bacitracin Streptomyces Bacillus Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Produkce vitamínů - Corynebacterium, Bacillus, Pseudomonas - Vitamín B2, B12 - Vitamín C – kombinace fermentace a chemické syntézy • Produkce aminokyselin - Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter - Kyselina glutamová – přídavná látka v potravinách - Lysin, threonin, tryptofan – doplněk krmiv - Cystein – přídavná látka v potravinách (chléb) Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Produkce organických kyselin – kyselina octová - Výroba octa – Acetobacter aceti - 2 CH3CH2OH + O2 2 CH3COOH + 2 H2O • Produkce organických kyselin - kyselina mléčná - Homofermentativní fermentace – Lactobacillus, Streptococcus - Potravinářství – sirupy, cukrovinky, konzervace - Chemická výroba – výroba plexiskla - Farmaceutický průmysl • Produkce biopolymerů – xantan - Xanthomonas - Potravinářský průmysl – salátové dressingy, omáčky, šunka, zmrzliny, pečivo – výrobky zůstávají déle čerstvé a křehké Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Produkce biopolymerů – dextran - Leuconostoc mesenteroides - Kosmetický průmysl, čištění vod, zemědělství – výroba biologicky odbouratelných polykationtů a polyaniontů - Potravinářství – stabilizátor hotových jídel, v cukrovinkách • Produkce organických rozpouštědel – butanol, aceton - Clostridium - Většina butanolu – z fosilních paliv - Chemické syntézy, složka hydraulických kapalin, parfémů Průmyslová mikrobiologie a biotechnologie • Produkce lidských proteinů - Inzulin, růstový hormon, fibrinogen, sérový albumin, interleukin • Produkce vakcín • Geneticky modifikované rostliny - Zlatá rýže – zdroj vitamínu A - Biologické pesticidy – Bt rostliny Konzumace toxinu kódovaného genem cry Bt toxin - letální pouze pro hmyz Krystaly Bt toxinu Přenos genu cry z Bacillus thuringiensis do rostliny Biotransformace – čištění odpadních vod Čerpací stanice Odpadní voda Skládka Písek, štěrk Primární sedimentace Aktivační nádrž Užitková voda, návrat do toku Dezinfekce Aerace Odvoz kalu Vratný kal Vyhnívací nádrž Odvodnění kalu Dosazovací nádrž – sekundární sedimentace Lapák pískuČesle Biotransformace – čištění odpadních vod • Anaerobní čištění odpadních vod a anaerobní stabilizace kalů - Rozklad organické hmoty na CO2, CH4, kyselinu octovou, vodu a minerální látky spojený s růstem anaerobních mikroorganismů – Clostridium, Bacteroides, Peptostreptococcus, Peptococcus, Lactobacillus, methanogenní archea • Čištění odpadních vod v anoxické zóně - Denitrifikace = odstraňování dusitanů a dusičnanů redukcí na N2O a N2 – Pseudomonas, Bacillus, Alcaligenes, Achromobacter, Thiobacillus Anaerobní zóna Oxická zóna - nitrifikacePřítok Odtok Anoxická zóna - denitrifikace Biotransformace – čištění odpadních vod • Čištění odpadních vod v oxické zóně - Rozklad organické hmoty na CO2, H2O a minerální látky - Nitrifikace = oxidace amoniaku na dusitany a dusičnany – Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrospira, Nitrobacter - Odstraňování fosforu – akumulace organicky vázaného fosforu do bakteriálních buněk – Acinetobacter Anaerobní zóna Anoxická zóna - denitrifikace Oxická zóna - nitrifikacePřítok Odtok Biotransformace – kompostování • Aerobní přeměna organického materiálu na kompost vlivem mikrobiální aktivity • Kompost = stabilizované organické látky a rostlinné živiny, především z rostlinných zbytků - Rozklad – houby, řasy, kvasinky, bakterie, roztoči, červi, chvostoskoci - Současně biosyntéza nových sloučenin – humin a huminové kyseliny Kompostování v zakládkách Kompostování ve vaku Biotransformace – bioremediace • Využití (mikro)organismů k dekontaminaci půd, kalů a podzemních vod • Aerobní mikroorganismy – rozklad organických polutantů na CO2, H2O a minerální látky • Anaerobní mikroorganismy – přeměna organických polutantů na méně škodlivé látky • Bakterie používané při bioremediacích – Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus, Rhodococcus, Sphingomonas Mikroorganismus a polutant Štěpení poluntantů Uvolnění produktů na netoxické produkty do vody a půdy Kyslík a živiny Trichlorethylen (TCE) TCE Oxid uhličitý Makroměřítko Mikroměřítko Přidání živin Odvod plynů Biotransformace – bioremediace Plastová fólie Provzdušňování Perforované potrubí Izolace Bioremediace in situ Bioremediace ex situ Biotransformace – bioremediace • Relativní schopnost biodegradace Jednoduché uhlovodíky Aromatické uhlovodíky Alkoholy, estery Nitrobenzeny Chlorované uhlovodíky Pesticidy Odbouratelnost Biotransformace – biologické loužení kovů z rud • Využití mikroorganismů pro získávání kovů z hlušiny – měď, uran Kyslík v aerované nádrži Pumpa Měď pro průmyslové využití Roztok bohatý na CuSO4 Fe0 (zbytky kovového železa) Rozstřikování Loužení vložené rudy obsahující Cu2S Oxidační nádrž: Thiobacillus ferrooxidans oxiduje FeSO4 na Fe3+ a H2SO4 (kyselý loužící roztok) Loužení: Fe3+ v kyselém loužícím roztoku oxiduje nerozpustný Cu2S (Cu+) na rozpustný CuSO4 (Cu2+) v v vCuSO4 se precipituje na měď (Cu0); Fe3+ je přeměněno na FeSO4 (Fe2+) v vv v vvv v v vRoztok bez mědi; železo ve formě FeSO4 Shrnutí Genové inženýrství Produkce antibiotik a vakcín Produkce enzymů Produkce lidských proteinů Produkce mléčných výrobků Produkce aminokyselin a vitamínů Produkce organických kyselin Produkce biopolymerů Přirozená mikroflóra Onemocnění dýchacích cest Onemocnění trávicí soustavy Onemocnění nervové soustavy Onemocnění kůže a ran Onemocnění pohlavních orgánů Sepse Bioremediace Čištění odpadních vod Kompostování Biologické loužení kovů z rud Koroze kovů Kažení potravin BAKTERIE Reference • Bednář M., Fraňková V., Schindler J., Souček A., Vávra J., Lékařská mikrobiologie, Marvil, Jihlava, 1996. • Chiller K., Selkin B.A., Murakawa G.J. (2001): Skin microflora and bacterial infections of the skin. JID Symposium Proceedings 6: 170-174. • Flint H.J., Scott K.P., Louis P., Duncan S.H. (2012): The role of the gut microbiota in nutrition and health. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 9: 577-589. • http://highered.mcgraw-hill.com/ • Monack D.M., Mueller A., Falkow S. (2004): Persistent bacterial infections: the interface of the pathogen and the host immune system. Nature Review Microbiology 2: 747-765. • Muyzer G., Stams A.J.M. (2008): The ecology and biotechnology of sulphatereducing bacteria. Nature Reviews Microbiology 6: 441-454. Reference • Prescott L.M., Harley J.P., Klein D.A., Microbiology (7th edition), McGraw-Hill, New York, 2007. • Rehm B.H.A. (2010): Bacterial polymers: biosynthesis, modifications and applications. Nature Reviews Microbiology 8: 579-592. • Votava M., Lékařská mikrobiologie speciální, Neptun, Brno, 2003. • Willey J., Sherwood L., Woolverton C., Prescott´s principles of microbiology, McGraw-Hill, New York, 2009. Animace • http://www.youtube.com/watch?v=PdXzQ7Ds6Q8 • http://www.youtube.com/watch?v=pXXvdv5Sibo • http://www.youtube.com/watch?v=ABqJF1YZhCo • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_1.html • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_2.html