Mgr. Šárka Bidmanová, Ph.D. Loschmidtovy laboratoře, Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita 77580@mail.muni.cz 1. Úvod do studia mikrobiologie 2. Archea 3. Bakterie 4. Fyziologie růstu bakteriální populace 5. Výživa a metabolismus bakterií 6. Metabolismus bakterií I 7. Metabolismus bakterií II 8. Genetika bakterií 9. Nejvýznamnější zástupci bakterií a jejich význam 10.Sinice 11.Kvasinky 12.Vláknité houby 13.Viry a priony Opakování – mikroskopické vláknité houby • Vláknité houby jsou vícebuněčné organismy s prokaryotickou buňkou. ○ Správně ○ Špatně • Buněčná stěna vláknitých hub je tvořena především z peptidoglykanu. ○ Správně ○ Špatně • Jádro buňky vláknitých hub je relativně malé s jedním kruhovitým chromosomem. ○ Správně ○ Špatně • Tělo vláknitých hub je tvořeno z hyf, které tvoří mycelium. ○ Správně ○ Špatně • U vláknitých hub s pigmenty probíhá fotosyntéza rostlinného typu. ○ Správně ○ Špatně Opakování – mikroskopické vláknité houby • Vláknité houby se rozmnožují pouze pohlavně. ○ Správně ○ Špatně • Sporangiospory jsou spory vznikající uvnitř sporangia. ○ Správně ○ Špatně • Zygospory se vytváří pohlavním procesem u rodů Penicillium a Aspergillus. ○ Správně ○ Špatně • K výrobě sýrů se využívají vláknité houby rodu Penicillium. ○ Správně ○ Špatně • Mykotoxiny jako produkty primárního metabolismu vláknitých hub způsobují onemocnění a otravy člověka. ○ Správně ○ Špatně 1. Úvod do studia mikrobiologie 2. Archea 3. Bakterie 4. Fyziologie růstu bakteriální populace 5. Výživa a metabolismus bakterií 6. Metabolismus bakterií I 7. Metabolismus bakterií II 8. Genetika bakterií 9. Nejvýznamnější zástupci bakterií a jejich význam 10.Sinice 11.Kvasinky 12.Vláknité houby 13.Viry a priony Viry • Nebuněčné živé soustavy • Intracelulární parazité na molekulární úrovni – využívají translační systém hostitele • Vně hostitelské buňky – metabolicky inertní • Nemají žádné organely • Reprodukce virů – syntéza jednotlivých složek • Zralé virové částice – jen DNA nebo RNA Viry • Původ - Bakterie, které ztratily organely - Část buněčného genomu, která získala schopnost se samostatně replikovat • Dělení dle hostitele - Živočišné viry - Rostlinné viry - Viry hub - Bakteriální viry - bakteriofágy - Adaptace na hostitele, střídání hostitelů Viry – velikost Bakteriofág T4 Rhinovirus 30 nm Adenovirus 90 nm 225 nm Virus vztekliny 170×70 nm Bakteriofág M13 800×10 nm Bakteriofágy f2, MS2 24 nm Virus tabákové mozaiky 250×18 nm Viroid 300×10 nm Elementární tělísko - Chlamydia 300 nm Prion 200×20 nmPoliovirus 30 nm Virus vakcínie 300×200×100 nm Virus Eboly 970 nm Escherichia coli 3000×1000 nm Viry – struktura a chemické složení • Virion = virová částice - Jednotlivá částice viru schopná infikovat hostitelskou buňku a množit se v ní - Stavba – nukleová kyselina, kapsid a obal • Chemické složení virionu - Nukleové kyseliny – obvykle jedna molekula DNA nebo RNA (nikdy obě!) - Proteiny – stavba kapsidu, enzymy – lysosym, RNA nebo DNA polymerasa, funkce ochranná, rozpoznávací, katalytická, regulační, antigenní - Lipidy – u obalených virů - Sacharidy – u obalených virů Viry – struktura • Kapsid - Proteinový obal kolem nukleové kyseliny viru - Soubor proteinových makromolekul → kapsomera → kapsid - Nukleokapsid = nukleová kyselina viru + kapsid Kapsomera Kapsid Nukleová kyselina Viry – kapsid • Ikozaedrální symetrie kapsidu - U živočišných virů - Dvacetistěn, stěny kapsidu – rovnostranné trojúhelníky z 6 kapsomer • Helikální symetrie kapsidu - U rostlinných virů - Sestavení kapsomerů šroubovicově do válcovitého kapsidu Ikozaedrální symetrie Helikální symetrie Nukleová kyselina Nukleová kyselina Kapsomera Kapsomera Viry – kapsid • Binární symetrie kapsidu - Především bakteriofágy - Hlavička – ikozaedrální symetrie, obsahuje nukleovou kyselinu - Bičík – helikální symetrie, nikdy neslouží k aktivnímu pohybu Kapsid (hlavička) Bičík Vlákna bičíku Bazální destička Hrot DNA 65 nm Viry - struktura • Nukleová kyselina viru - Velikost genomu – 3-670 kbp - dsDNA – nebývá u rostlinných virů - ssDNA – živočišné viry – lineární, bakteriofágy – kružnicová - dsRNA – segmentace genomu, uložení ve společném kapsidu - ssRNA – častá segmentace genomu, u rostlinných virů segmenty v oddělených kapsidech - Rozdělení virů podle genomu – DNA viry, RNA viry, RNA-DNA viry (využívají DNA i RNA, ale v různých stádiích reprodukčního cyklu) Viry - struktura • Obal virů - Přítomen u větších virů, neobalené viry – chráněny pouze kapsidou - Vznik z membrány hostitelské buňky – fosfolipidová dvojvrstva s proteiny - Některé viry – hroty – z glykoproteinů, nápadné výčnělky - Některé viry – v obalu charakteristické proteiny – např. hemaglutinin, neuraminidasa Hroty Obalený virus Virus chřipky Hroty Obal Nukleová kyselina Kapsomera Viry - reprodukce • Rozmnožování virů zcela závislé na hostitelské buňce • Reprodukční cyklus - Vazba virionu na povrch buňky (adsorpce) - Proniknutí do buňky - Uvolnění nukleové kyseliny z kapsidu - Replikace virové nukleové kyseliny - Syntéza virových proteinů - Zrání (maturace) virionů - Uvolnění virionů z buňky Viry – metody studia • Pro růst virů – nezbytné živé buňky • Hostitelské buňky bakteriofágů – bakterie • Kvantifikace virových částic - Přímé počítání virionů pod elektronovým mikroskopem - Plaková metoda – smíchání viru, bakterie a agaru, rozlití na kultivační misky a inkubace, virus lyzuje buňky – tvorba plaků Plaky Viry – metody studia • Kvantifikace virových částic - Hemaglutinace – nepřímá metoda Červené krvinky Viriony Hemaglutinace 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 Kontrola Jamky mikrotitrační destičky 1:160 1:320 Viry – metody studia • Kultivace živočišných virů - Metoda tkáňových kultur – buňky tvoří monovrstvu na povrchu kultivační nádoby – růst omezený počet generací nebo stále (nádorové buňky) - Působení virů na hostitelskou buňku: - Lyze buněk rostoucích v monovrstvě – tvorba plak - Změna vzhledu buněk – cytopatický efekt - Srážení červených krvinek interakcí s povrchem dvou buněk Normální buňky Transformované buňky Cytopatický efekt Viry – metody studia • Kultivace živočišných virů - Kuřecí embrya - Pokus na zvířeti Vzduchová komůrka Skořápka Chorioallantoická membrána Amniotická dutina Bílek Allantoická dutina Papírová blána Žloutkový vak Viry – vliv fyzikálních faktorů • Sucho - Vysoušení virů při teplotě > 0°C – rychlá ztráta aktivity - Lyofilizace – zachování aktivity • Teplota - Vliv na proteiny a nukleové kyseliny - 60°C po 30 min – pro většinu virů letální • Ultrazvuk - Vysoká intenzita – inaktivace virů, dezintegrace kapsidu a uvolnění nukleové kyseliny • Záření - Rentgenové a γ-záření – fragmentace nukleové kyseliny viru - UV záření – poškození nukleové kyseliny viru, tvorba dimerů tyminu Viry – vliv chemických faktorů • Dezinfekční látky - Fenol – denaturace proteinů, ztráta infekčnosti viru - Těžké kovy – sloučeniny rtuti – působení ve vyšších koncentracích - Oxidační činidla – H2O2, KMnO4, halogeny – inaktivace viru poškozením proteinů - Plyny – formaldehyd, β-propiolakton – inaktivace virů bez poškození antigenů – výroba vakcín - Povrchově aktivní látky – působí obnažení nukleové kyseliny viru - Organická rozpouštědla – koagulace proteinů, rozpouštění lipidů – diagnostika • Protivirová chemoterapeutika – strukturní analogy virových nukleových kyselin a proteinů - Interferon a nukleosidové analogy Viry - bakteriofágy • Specifické rozmezí hostitelských buněk – často Escherichia, Salmonella, Shigella, Clostridium • Vstup pouze genomu fága do hostitelské buňky, obalové struktury zůstávají vně buňky • Klasifikace podle tvaru virionu - Bakteriofágy s dlouhým bičíkem - Bakteriofágy s krátkým bičíkem - Bakteriofágy bez bičíku Viry – reprodukce bakteriofágů • Lytický cyklus T4 bakteriofág u Escherichia coli Kapsid Bičík Vlákna bičíku Bazální destička Hrot Buněčná stěna Plasmatická membrána Stažený bičík Injekce nukleové kyseliny do buňky ChromosomBuněčná stěna bakterie Kapsid DNA Adsorpce Penetrace Biosyntéza Viry – reprodukce bakteriofágů • Lytický cyklus • Virulentní fágy – způsobují pouze lytickou infekci hostitelské buňky Uvolnění Vlákna bičíku Kapsid DNA Maturace Viry – reprodukce bakteriofágů • Jednostupňová růstová křivka bakteriofága - Analýza počtu virionů v různých časech po adsorpci na hostitelskou buňku - Latentní fáze – počet virionů nevzrůstá - Fáze vzestupu – uvolnění virionů z buněk - Fágový výnos („burst size“) – počet virionů vytvořených jednou buňkou Adsorpce Čas (min) Početinfekčníchfágových částic(log) Fágový výnos Penetrace Biosyntéza a maturace Viry – reprodukce bakteriofágů • Lyzogenní cyklus - Temperované fágy – vyvolávají buď lytickou infekci hostitelské buňky nebo její lyzogenizaci - V lyzogenní buňce – integrace nukleové kyseliny viru do chromosomu hostitelské buňky – vznik profága - Lyzogenní buňka – imunní vůči infekci stejným fágem - Aktivace lytického cyklu – působením faktorů poškozujících DNA (UV záření) Viry – reprodukce bakteriofágů • Lyzogenní cyklus Lytický cyklus Lysogenní cyklus Profág Bakteriální chromosom Fágová DNA Mnohonásobné dělení buňky Cirkularizace DNA, vstup do lytického nebo lysogenního cyklu Syntéza fágové DNA a proteinů, sestavování virionů Lyze buňky, uvolnění virionů Adsorpce fága, injekce DNA Uvolnění profága z chromosomu, začátek lytického cyklu Normální reprodukce lysogenní bakterie Vstup fágové DNA do bakteriálního chromosomu rekombinací, vznik profága Viry – reprodukce bakteriofágů • Lyzogenní cyklus Profág gen gal Gal+ donorová buňka Gen gal Gal- recipientní buňka Gal+ rekombinantní buňka Profág v hostiteli využívajícím galaktosu Vystřižení fágového genomu, nese gen gal Maturace fága a lyze buňky Infekce buňky, která nevyužívá galaktosu Integrace profága do hostitelské DNA Lysogenní buňka může metabolizovat galaktosu Viry – živočišné viry • Do hostitelské buňky vniká většinou celý virion • Některé obalené viry – zbaveny obalu a kapsidu na cytoplasmatické membráně • Reprodukce živočišných virů - Většinou v jádře hostitelské buňky - Kroky stejné jako u bakteriofága, odlišný počet fází Viry – reprodukce živočišných virů • Vazba virionu na povrch hostitelské buňky • Proniknutí do buňky – endocytoza nebo fúze Fúze obalu viru a cytoplasmatické membrány Endocytoza Viry – reprodukce živočišných virů • Obnažení virové nukleové kyseliny – pomocí hostitelských nebo virových enzymů • Biosyntéza – replikace virové nukleové kyseliny a syntéza proteinů • Zrání (maturace) virionů • Uvolnění z hostitelské buňky – pučení nebo lyze buňky Kapsida viru Cytoplasmatická membrána hostitelské buňky Virový protein Pupen Pupen Obal Viry – reprodukce dsDNA virů Kapsidové proteiny mRNA DNA Kapsid Cytoplasma Jádro Hostitelská buňka Papovavirus Adsorpce Pozdní translace – replikace DNA Časná transkripce a translace – syntéza enzymů Pozdní translace – syntéza kapsidových proteinů Maturace Uvolnění virionů Penetrace Viry – reprodukce +ssRNA virů Adsorpce Kapsid RNA Jádro Cytoplasma Penetrace Protein viru + řetězec + ssRNA Genom viru (RNA) Kapsidový protein Translace a syntéza virových proteinů mRNA – vznik podle - řetězce RNA replikace – vznik - řetězce Maturace a uvolnění Viry – reprodukce ssRNA virů se zpětnou transkriptasou Kapsid Obal Reverzní transkriptasa Virové proteiny Virová DNA Provirus Hostitelská buňka Maturace, zisk obalu pučením Reverzní transkriptasa Virová RNA Identické řetězce RNA Chromosomální DNA Penetrace Reverzní transkriptasa produkuje dsDNA Integrace virové DNA do chromosomu – množení proviru s hostitelskou buňkou Transkripce proviru – produkce genomové RNA a RNA kódující kapsid a obalové proteiny Identické řetězce RNA Viry – interakce živočišného viru s hostitelem • Viry většinou nezpůsobují zjevné nemoci • Zdraví lidé a zvířata – často přenašeči různých virů • Akutní infekce – obvykle rychlý průběh, virus postupně eliminován z organismu, např. příušnice, spalničky • Perzistentní infekce – dlouhodobá infekce, replikační cyklus viru zablokován - Chronické infekce – virus lze v organismu prokázat, ale nevyvolává chorobné příznaky - Latentní infekce – virus se v organismu nereplikuje, nelze prokázat, replikace viru aktivována teplotou, UV zářením, např. pásový opar Viry a nádory • Transformující viry – viry narušující kontrolu normálního růstu buňky • Mechanismus transformace buňky viry - Narušení funkce důležitých enzymů - Tvorba defektních proteinů - Zvýšená exprese genů pro kontrolu replikace a transkripce • Nádory způsobené DNA viry – výsledek integrace a exprese virové DNA v hostitelské buňce • Nádory způsobené RNA viry (retroviry) – RNA je kopírována do DNA, její integrace do chromosomu hostitele • Viry vyvolávající nádory u člověka – virus Epsteina-Barrové, virus hepatitidy B, lidský papillomavirus, retroviry Viry – nejvýznamnější zástupci Genom, obal viru Velikost Čeleď Virion Zástupci dsDNA neobalené viry 70-90 nm Adenoviridae Mastadenovirus respirační onemocnění 40-57 nm Papovaviridae Papillomavirus – tvorba nádorů dsDNA obalené viry 200-350 nm Poxviridae Orthopoxvirus – pravé neštovice 150-200 nm Herpesviridae Simplexvirus – opar, Varicellovirus – plané neštovice, pásový opar 42 nm Hepadnaviridae Hepadnavirus – virus hepatitidy B, nádory jater Viry – nejvýznamnější zástupci Genom, obal viru Velikost Čeleď Virion Zástupci +ssRNA neobalené viry 28-30 nm Picornaviridae Rhinovirus – respirační onemocnění (rýma) +ssRNA obalené viry 60-70 nm Togaviridae Rubivirus – zarděnky 40-50 nm Flaviviridae Virus hepatitidy C Virus klíšťové encefalitidy 100-120 nm Retroviridae Virus HIV – AIDS, viry vyvolávající nádory Viry – nejvýznamnější zástupci Genom Velikost Čeleď Virion Zástupci -ssRNA, nesegmentovaný genom 70-180 nm Rhabdoviridae Virus vztekliny 150-300 nm Paramyxoviridae Paramyxovirus – parachřipka, Morbillivirus – spalničky, Rubulavirus – příušnice -ssRNA, segmentovaný genom 80-200 nm Orthomyxoviridae Influenzavirus – virus chřipky Viry – vakcíny • Živé atenuované vakcíny – snížená virulence, snížená schopnost množení virů, infekce bez klinických příznaků • Heterologní vakcíny – využití příbuzných virů s nižší virulencí, ale se stejnými antigeny jako původce onemocnění • Inaktivované vakcíny – inaktivace virů β-propiolaktonem, formaldehydem, vakcína neinfekční • Subjednotkové vakcíny – využití purifikovaného antigenu viru nebo rekombinantní (vpravení genu kódujícího antigen do vektoru, exprese genu v hostitelské buňce, extrakce a purifikace antigenu) Viry – rostlinné viry • Původci závažných onemocnění rostlin - Žloutnutí listů, kroužky a čáry na listech, nevyvinuté rostliny, někdy abnormální růst • Zejména RNA viry • Mechanismus přenosu rostlinných virů - Neváží se na specifické receptory, vstup poraněními v buněčné stěně - Velmi odolné k inaktivaci - Přenos – semeny, hlízami, pylem, hmyzem, z půdy Mozaika okurku Mozaika okurku Šarka švestek Defektní viry a viroidy • Defektní viry = viry parazitující na jiném viru - Satelitní viry – využití nepříbuzných virů infikujících stejné hostitelské buňky • Viroidy - Krátká ssRNA - Neobsahují proteinový obal - Replikace zcela závislá na hostiteli - Původci rostlinných chorob Viroid vřetenovitosti u bramborových hlíz Priony • Prion = proteinová infekční částice, neobsahuje nukleovou kyselinu • Mechanismus infekce - Hostitelské buňky obsahují protein PrPC - Prionový protein PrPSc modifikuje PrPC - PrPSc se hromadí v buňkách - Způsobují smrtelné neurodegenerativní nemoci – Creutzfeldtova-Jakobova choroba, nemoc šílených krav, klusavka ovcí a koz Lysosom Endosom PrPSc Shrnutí Bakterie* Viry Intracelulární parazité Ne Ano Přítomnost cytoplasmatické membrány Ano Ne Binární dělení Ano Ne Přítomnost DNA i RNA Ano Ne Metabolismus produkující ATP Ano Ne Ribosomy Ano Ne Citlivost k antibiotikům Ano Ne Citlivost k interferonu Ne Ano * Odlišnosti u ricketsií a chlamydií Reference • Brandenburg B., Zhuang X. (2007): Virus trafficking – learning from single-virus tracking. Nature Reviews Microbiology 5: 197-208. • Dimitrov D.S. (2004): Virus entry: Molecular mechanisms and biomedical applications. Nature Reviews Microbiology 2: 109-122. • http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap13/ss1.htm • http://highered.mcgraw-hill.com/ • Miller S., Krijnse-Locker J. (2008): Modification of intracellular membrane structures for virus replication. Nature Reviews Microbiology 6: 363-374. • Rosypal S., Nový přehled biologie, Scientia, Praha, 2003. • Rosypal S. a kol., Obecná bakteriologie, SPN, Praha, 1981. • Šilhánková L., Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology, Academia, Praha, 2008. • Willey J., Sherwood L., Woolverton C., Prescott´s principles of microbiology, McGraw-Hill, New York, 2009. Animation • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter17/animation_quiz_1.html • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter17/animation_quiz_2.html • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter18/animation_quiz_1.html • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter18/animation_quiz_2.html • http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter18/animation_quiz_3.html • http://www.professorcrista.com/files/animations/posted_animations/prions_char acteristics.html