Biologie vitaminu A a jeho úloha ve fyziologii živočichů E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223 / 116 KAROTENOIDY von Linting, 2006 - Vitamin A jsou obecně lipofilní látky podobné struktury a aktivity (retinol, retinal, kyselina retinová) - Prekurzory retinoidů jsou karotenoidy, zejména b-karoten (~ 50 z >400 je využitelných) - Nejdůležitejším derivátem je kyselina retinová (RA), odvozená od retinalu - Tělo je přijímá v potravě, karotenoidy v rostlinné, vitamin A a jeho deriváty v živočišné RETINOIDY retinyl estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinová (vit. A) (RA – retinoic acid) Retinol equivalent (RE) = retinol v potravě (µg) + b-karoten (µg) + ostatní karotenoidy (µg) 6 12 RE u žen ~ 800 mg na den RE u mužů ~ 1000 mg na den STRUKTURY NEJBĚŽNĚJŠÍCH PŘIROZENÝCH RETINOIDŮ Ross, 2000 karoteny & retinoidy (potrava) retinyl estery Retinoidy jsou resorbovány v tenkém střevě, v enterocytech se karotenoidy mění na aktivní retinoidy (retinyl estery), s lipidy a dalšími lipofilními látkami tvořícími chylomikrony jsou uvoněny do lymfatického systému odkud se postupně uvolňují do celkového tělního oběhu. Zásoba je vytvářena v játrech (50-85% celkového) v lipidových kapénkách ve hvězdicovitých buňkách jater. Distribuce retinoidů v organismu - 90% retinoidů je v těle v podobě retinyl esterů v lipidové složce chylomikronů, část jich může být i přímo v buněčných membránách. - beta-karoteny mohou být navíc uloženy v tukové tkáni - v případě potřeby (mobilizace zásob) je retinol uvolňován z jater do krve, vázaný s v hepatocytech syntetizovaným proteinem RBP (retinol vázající (binding) protein). Tento komplex (holo-RBP) se váže s transthyretinem (TTR, prealbumin), čímž je zabráněno vylučování retinolu v ledvinách. Takto v plasmě cirkulující retinol je připraven ke zpracování v cílových buňkách. - K přeměně na koněčné funkční retinoidy dochází až v místě spotřeby. ! Retinoidy tedy působí zejména autokrinně a parakrinně ! Distribuce retinoidů v organismu Kyselina retinová (RA) MORFOGEN & TERATOGEN PLEIOTROPNÍ VLASTNOSTI V průběhu embryonálního vývoje je metabolismus RA nezbytný zejména pro formování tělní osy a segmentaci (Hox geny), vývoj CNS, očí, srdce, ledvin, pohlavních orgánů, a epitelů obecně. U dospělců se pak podílí zejména na udržování homeostáze imunitního systému, epitelů a zrání pohlavních buněk (spermatogenezi). Výběr nejvýznamějších oblastí vyžadujících metabolizmus retinolu/vit.A A) fotorecepce B) růst a vývoj organismu Ross, 2000 Marie Virtanen, Hans Törmä and Anders Vahlquist J.Invest. Dermatol. Účinek RA na epidermis Úloha RA ve vývoji plic Úloha RA ve vývoji plic ÚLOHA RETINOIDŮ VE FOTORECEPCI retinyl estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinová (vit. A) (RA – retinoic acid) Mechanismy regulující účinky RA v buňce - proteiny jejího metabolismu a) Enzymy Metabolismus retinoidů, zejména oxidace. b) Retinoidy vázající proteiny Zásoba v buňce, regulace jejich intracelulární koncentrace, transport. c) Jaderné receptory RA (transkripční faktory) Realizace transkripce na RA závislých i nezávislých genů. REGULACE RA na buněčné úrovni V regulaci ontogeneze je klíčovým retinoidem kyselina retinová – RA, a to její izoformy all-trans a 9-cis. Ross, 2000 McCaffery, 2000 ENZYMY - I Retinol dehydrogenázy : oxidace RETINOLU -> RETINALALDEHYD Dvě skupiny alkoholdehydrogenáz, třída I a IV. Přitom třída I se zdá málo významná pro metabolismus retinoidů, oproti třídě IV, kterou lze detekovat v oblastech intenzivního metabolismu retinoidů od 10 dpc (myš). Pravděpodobně se ale uplatňují i membránově vázané alkohol dehydrogenázy (známe 2 co oxidují retinol), upřednostňují však pouze 9-cis isomery. ENZYMY metabolismu RA ENZYMY - II 2) Retinaldehyd dehydrogenázy : oxidace RETINALDEHYDŮ -> KYSELINU RETINOVOU Tato reakce může být katalyzována i aldehyd nebo xanthin oxidázami, ale převážně je řízena retinaldehyd dehydrogenázami. Byly identifikovány 3 typy, RALDH, které s liší specifitou k retinaldehydům a distribucí v organismu. RALDH1 (=AHD2, ALDH1) ačkoliv je relativně málo aktivní, je silně exprimována v retině, a tak prakticky všechna RA v retině je produktem tohoto enzymu. Dále je během embryogeneze exprimována ve středním mozku (mesencefalon) a v corpus striatum. Váže také androgeny a je možné, že tak zprostředkovává interakci mezi RA a androgenními jadernými receptory. RALDH2 je vysoce selektivní k retinaldehydům. Začíná se exprimovat již v průběhu gastrulace A odpovídá za produkci RA ve všech tkáních závislých na RA (mozek - zejména motoneurony, mícha, srdce, ledviny, pohlavní orgány,…). RALDH2 -/- embrya hynou v důsledku neuzavření nervové trubice a poruch ve vývoji srdce, přídavkem RA, lze tyto efekty potlačit. RALDH3 (=V1) je sice vysoce aktivní enzym, ale málo specifický k oxidaci rentinaldehydům. U časných embryí je exprimována ve ventrální části retiny a v gangliích koncového mozku (telencephalon). Později je přítomen zejména v játrech a kůži. Společně s RALDH1 u embryí katalyzuje přeměnu gamma-aminobutyraldehydu na GABA. ENZYMY - III CYP26 (=P450RAI) : oxidace KYSELINY RETINOVÉ -> KYSELINU 4-OXORETINOVOU (Hydroxyláza kyseliny retinové, dvě formy CYP26A1 a CYP26B1) CYP26 je členem velké rodiny cytochromů P450. V současné době je jediným známým enzymem katabolizujícím RA. Exprese CYP26 je indukována RA, a je přítomen minimálně ve všech buňkách s metabolismem RA a v buňkách citlivých k působení RA. Jeho podíl na deaktivaci RA není však plně objasněn. Např. u žab, 4-oxoRA je silným aktivátorem receptorů RA a tak i buněčných regulací citlivých k RA. Je pravděpodobné, že enzymů metabolizujících retinoidy je více, avšak s menším významem než výše jmenovaní. Jejich exprese, podobně jako syntéza RA je v průběhu embryonálního vývoje velice dynamická v závislosti na typu tkáně a vývojovém období. Obecně je souhra v jejich expresi a aktivitě nezbytná pro segmentaci (zejména regulace Hox genů) vyvíjejícího se embrya. Retinoidy vázající proteiny 1) Intracelulární a) Buněčný retinol vázající protein (CRBP – cellular retinol binding protein) Váže retinol i retinaldehyd a chrání je před oxidacemi a světlem. Retinol vázaný na CRBP-1 však může být oxidován na retinaldehyd retinol dehydrogenázou. Uvolněný retinaldehyd je pak přístupný pro oxidaci RALDH na RA. b) Buněčný RA vázající protein (CRABP – cellular RA binding protein) CRABP-I chrání RA před další metabolizací podobně jako CRABP-II, který je však přítomen nejen v cytoplasmě, ale i v jádře, asociuje s receptory pro RA a slouží tak i jako transkripční regulátor / kofaktor. Je zajímavé, že absence CRBP a CRABP (knock-out myši) má minimální účinek na fenotyp organismu, na rozdíl od vypnutí některého z enzymů (viz. výše) nebo receptorů (viz. níže). 2) Vázané na membránu Megalin (gp330 / LRP-2) - patrří do rodiny LDL (low-density lipoprotein) receptorů. Je exprimován v membránách zejména epiteliálních buněk a slouží jako receptor pro RBP a retinol (a také sonic hedgehog (Shh)). Megalin zprostředkovává transport retinolu (vázaného jak na RBP tak LDL) skrze vrstvy epiteliálních buněk, ale i do jejich intracelulárního prostoru. V ledvinách se podílí i na transportu dalších lipofilních vitaminů (např vit. D + vit. D vázající protein, vit. B12 + transcomalamin). Komplex ligand – megalin je pohlcen procesem endocytózy a vzniklý endosom cestuje buňkou na místo určení. Retinoidy vázající proteiny Receptory RA Receptor RA = RAR = retinoic acid receptor (RARa, RARb, RARg + isoformy) RAR je aktivovaný jak all-trans RA, tak 9-cis RA Receptor retinoidu X = RXR = retinoid X receptor (RXRa, RXRb, RXRg + isoformy) RXR je aktivovaný pouze 9-cis RA RA receptory patří do rodiny jaderných receptorů společně s receptory thyroidních hormonů, receptorem vit. D, receptory aktivujícími peroxisomové proliferátory (PPARs), jaterním X Receptorem (LXR), farsenoidovým receptorem (FXR) a se sirotčími (orphan) receptory. S těmi zde jmenovanými RXR tvoří také heterodimery regulující transkripci mnoha ontogeneticky významných genů. Regulace genů řízených RA je zprostředkována jejími receptory, které zároveň slouží i jako transkripční faktory. Vytvářejí funkční homo (RAR/RAR, RXR/RXR) i heterodimery (RAR/RXR), přičemž heterodimery jsou výrazně transkripčně silnější/aktivnější. Jejich kombinace (48) jsou specifické pro konkrétní promotorové sekvence (response elements) v promotorech RA indukovaných genů. Signální dráha jaderných receptorů DNA DNA transkripce on / off ? TF TF NR NR NR NR NR ligandy jaderné (nuclear) receptory transkripční faktory transkripce on / off ? Příklady promotorových sekvencí s RAR/RXR vazebnými místy Ross, 2000 Srovnání některých defektů vyvolaných nedostatkem RA (RAD), oproti vyřazení jednotlivých receprotů RAR nebo RXR Ross, 2000 Obecně vyřazení jednotlivých isoforem receptorů (homozygoti -/- RARa1, RAb2 nebo RARg2) nemá žádný zásadní účinek na fenotyp takových zvířat. Po vyřazením jednotlivých subtypů, však již můžeme pozorovat různé malformace a nedostatečnosti. Z RAR se jeví nejvýznamnější RARg. Větší účinek má vyřazení RXR, které je způsobeno pravděpodobně jejich úlohou při vytváření heterodimerů s ostatním jadernými receptory. RXRa -/-, hyne 13.5-16.5 dpc, z důvodu nedostatečně vyvinutého srdce, má také nedostatečně vyvinuté oči. RXRb -/- je viabilní ale samci jsou sterilní. Interakce transkripční aktivity RA a některých drah transdukce signálu Aktivní komplex RAR/RXR v mnoha případech působí jako represor v promotorech rozpoznávaných také AP-1 (Jun/Fos komplexy) a Smad proteiny (TGFb rodina). Na druhou stranu, aktivita RA receptorů může být modifikována jejich fosforylací na serinových a threoninových zbytcích serin/threonin kinázami. A to zejména MAPK kinázami (Erk; JNK1,2,; p38), protein kinázou A (PKA) a na cyklinu H závislou cdk7. Tyto postranslační modifikace RA receptorů vedou k další variabilitě v možnostech regulovat RAR/RXR řízenou transkripci jak pozitivně, tak negativně a to i za nepřítomnosti ligandu (RA). Modifikují, zejména interakce s dalšími proteiny transkripčního komplexu. Některé fosforylace (např. p38 -> RARg) indukují degradaci daných receptorů) Inhibice AP-1 zprostředkované transkripce kyselinou retinovou RXRa / RXRa A/B DC FE A/B DC E LBD/AF-2DBDAF-1 LBD/AF-2DBDAF-1 EEIVPS74PPS77PPPLPR EELVPS67PPS70PLPPPR EEMVPSS66PS68PPPPPR EEMVPSS77PS79PPPPPR RARa1 RARb2 RARg2 RKRRPS369RP RKRRPS362KP RRRRPS360QP RRRRPS371QPRARg1 RXRa SSSLNS22PTGR….S44P.. S48P.. S54P… SS61P.. SS75P..PTT87P S96P..S101P LNPSS265PNDP Serinové a threoninové zbytky fosforylované (■) u RAR/RXR receptorů, ukázány jsou i potencionálně fosforylovatelné(čísla) AF-1 (A/B doména) – oblast regulující aktivaci transcripce, nezávisle na ligandu DBD (C doména) – DNA vázající doména (DNA-binding domain) LBD/AF-2 (D/E doména) – oblast regulující aktivaci transkripce, závislé na ligandu PKAMAPKs + cdk7 JNK1 + JNK2 NN- -C -C Jedna z možných interakcí metabolismu RA s promocí nádorového onemocnění Systém pro detekci RA v buňkách/tkáních (RARE-LacZ reportér) RARE * LacZ RAR RXR RA RA RA RA Xn* b-galaktozidáza X-Gal X-Gal X-Gal X-Gal X-Gal *další faktory/sekvence nezbytné pro funkci promotoru Exprese a aktivita RALDH-2 v mozku myšího embrya (16 dpc) A) In situ hybridizace mRNA RALDH-2 B + C) RARE aktivita (RARE-LacZ reporter) Detekce epxrese CYP26 (in situ mRNA hybridizace) v retině (A) a RARE aktivita (RARE-LacZ reporter) v embryonální retině (čelní a zadní pohled)(B) 13 dpc 2 ds postnatal 13.5 dpc 16 dpc McCaffery, 2000  Klinické využití kyseliny retinové a jejich derivátů - kožní onemocnění (viz. Tab.1 další slide) - různá onkologická onemocnění – stále předmětem výzkumu - akutní promyelocytická leukémie (spojeno s translokací RARa -> potlačení jeho fce) - včetně retinoidů také inhibitory degradace RA - inhibitory cytochromu P450/CYP26 (zejména dermatologie)  Experimentální využití kyseliny retinové - vděčné diferenciační činidlo, induktor diferenciace mnoha typů nádorových buněk, ale i embryonálních kmenových a jim příbuzných buněk Retinoidy využívané v dermatologii Literatura ke studiu 1. Clagett-Dame, M., and L. A. Plum. 1997. Retinoid-Regulated Gene Expression in Neural Development. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression 7:299-342. 2. Clagett-Dame, M., and H. F. DeLuca. 2002. The Role of Vitamin A in Mammalian Reproduction and Embryonic Development. Annu. Rev. Nutr. 22:347-381. 3. Maden, M., and M. Hind. 2003. Retinoic Acid, A Regeneration-Inducing Molecule. Developmental Dynamics 226:237-244. 4. McCaffery, P., and U. C. Drager. 2000. Regulation of retinoic acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine & Growth Factor Reviews 11:233-249. 5. McCarthy, R. A., and W. S. Argraves. 2003. Megalin and the neurodevelopmental biology of sonic hedgehog and retinol. J. Cell Science 116:955-960. 6. Napoli, J. L. 1999. Interactions of retinoid binding proteins and enzymes in retinoid metabolism. Biochimica et Biophysica Acta 1440:139-162. 7. Rochette-Egly, C., and P. Chambon. 2001. F9 embryocarcinoma cells: a cell autonomous model to study the functional selectivity of RARs and RXRs in retinoid signaling. Histol Histopathol 16:909-922. 8. Ross, S. A., P. J. McCarffery, U. C. Drager, and L. M. De Luca. 2000. Retinoids in Embryonal Development. Physiological Reviews 80:1021-1054. Shulman2005 RXR x metabolic syndrome