Mt DNA a cytoplazmatická samčí sterilita (CMS) u rostlin □ CMS kódována mitochondriálním genomem □ 150 druhů, 20 čeledí □ Kukuřice - 3 plazmotypy cmsT, cmsS, cmsC, □ více jaderných genů obnovy Rfl, Rfl, Rf3, Rf4 až Rf8 Mt gen URF-13 tvoří aldehydy toxické pro mitochondrie buněk tapeta Rf2 tvorba alkoholdehydrogenár odstraňuje toxické látky Využití samčí sterility ve šlechtění □ Výroba hybridního osiva □ Heterózní šlechtění □ □ i r Rfl Nucleus Plant phenotype urfl3 transcripts/ URF13 proteins Restorer genotype CMS High rfl rfl CMS Low Rfl rfl CMS High rfl Rfl Fertile None detected Rfl Rfl Klonované mitochondriální geny pro CMS u jednotlivých rostlinných druhů ^WWWWR^SHWBRW z různých genu i jaderných orfl38 orfB Ogura CMS (radish, Brassica) T-urfl3 orf221 I L Texas CMS (maize) orß24 aípó polima CMS (Brassica) Pcf nad3 Petunia CMS atpA or/522 Pďiolaris CMS (sunflower) atpA pvs-orf239 beán CMS Chloroplastové genové inženýrství rostlin Historie □ 1980 První introdukce izolovaných chloroplastů do protoplastů □ Biolistická metoda transformace (bombardování mikroprojektily) □ 1988 První plastidová transformace zelené řasy Chlamydomonas reinhardtii □ Mutant v genu atpB po bombardování mikroprojektily s DNA wt atpB genu = introdukovaný gen opravil původní nefunkční gen atpB - gen pro podjednotku ATP syntázy □ Úspěšná komplementace, stabilní integrace do plastidového genomu Plastidy rostlin jsou ideálními kandidáty pro genové inženýrství Výhody □ 1. Vysoká úroveň exprese plastidových genů □ Kolik kopií každého genu je obsaženo v 1 buňce potenciálně transformované? □ 2. Maternální dědičnost □ 3. Absence pozičníhq efektu - viz způsob introdukce transgenů homologní rekombinací □ 4. Absence epigenetickýchovlivů - nedochází ke změnám v regulaci genů a k jejich umlčování Introdukce transgenu do cpDNA homologní rekombinací Inaktivace cp genu pro fotosyntézu Transformací (gen Rubisco) TRENDS in Biotechnology Regenerace rostlin Bílé sektory -po transformaci homoplazmie -organogeneze -somatická embryogeneze podmínky in vitro Plastid transformation vector A aadA B Gene delivery Selection \ Regeneration Additional rounds of selection and regeneration I s 1 4 1 1 1 1 \ V \ í 1 1 i ŕ 1-r-A B ptDNA aadA Shoot proliferation and rooting TRENDS in Biotechnology aadA - kóduje rezistenci k antibiotiku spektomy-cinu a streptinomycinu Místo začlenění transgenu az Tvorba funkčního proteinu □ Poznatky plastidové genomiky - sekvenování cpDNA, nezbytnost pro tvorbu vektoru □ Vektory pro transformaci - univerzální vektor neexistuje □ Efektivní regenerace rostlin somatickou embryogenezí □ Vyloučení genů pro antibiotika z vektoru □ Stabilní integrace a stabilní exprese genu □ Tvorba funkčního proteinu □ Ekonomická produkce cizích proteinů ?Bezpečnost - rizika? Rezistence k antibiotiku u transgenních rostlin Praktické aspekty chloroplastového inženýrství Cíle Zlepšení agronomických vlastností □ Rezistence k hmyzu □ Rezistence k herbicidům □ Rezistence k chorobám - původci bakterie, houby □ Tolerance k suchu □ Tolerance k zasolení □ Fytoremediace Terapeutické proteiny Biomateriály Průmyslové enzymy Spektrum druhů □ Tabák □ Mrkev □ Bavlník □ Sója Rezistence k herbicidům y □ Totální herbicid, inhibuje enzym EPSPS nezbytný pro syntézu aromatických aminokyselin. Rostlina uhyne. □ Transformace geny pro necitlivost ke lyfosátu: Gen EPSPS z bakterie obsahuje odovou mutaci, proto není gen qlyfosátem blokován. Funkce enzymu je zachována. □ Chloroplastová transformace Petunia hybrida □ Gen arok mezi geny trní a trn/K v jedné IR □ nebo rbcL a accD v LSC □ Rezistence vůči 5 mM glyfosátu (lOx vyšší —než letální)- □ 250x vyšší exprese ve srovnání s expresí v iadernem aenomu Fosfinotricin Totální herbicid, blokuje enzym glutaminsyntázu, který odbourává amoniakové ionty. Rostlina uhyne vlivem hromadění amoniaku. Transformace tabáku geny pro necitlivost k herbicidu Gen bar z bakterie - kóduje enzym, který přeměňuje herbicid na netoxickou sloučeninu Nižší exprese genu, dostatečná polní rezistence Rezistence k hmyzu □ Geny Cry pro hmyzí protoxiny z Bacillus thuringiensis. Toxické pro larvální stadia hmyzu. □ Receptory v trávicím traktu hmyzu vážou specificky protoxiny - toxický účinek. Specifita = určitý gen Cry proti určitému druhu škodlivého hmyzu. □ Transformace tabáku: Operón Cry2Aa2 obsahuje geny Cry2Aa2 gen pro vlastní toxin orfl, orf2 geny pro chaperony, které zajišťují tvorbu funkčního protoxinu □ 46% celkových proteinů chloroplastu (tsp - total soluble protein) Škůdce tabáku černopáska Transformace cpDNA tabáku Účinná exprese genů a účinná výsledná rezistence Heliothis-j)elífgera'348 Rezistence k patogenum □ MSI-99 syntetický analog magaininu-2, 0 agtimikrobiální peptid - izolovaný ze sekretu kuže drápatky vodní □ Mechanizmus jeho působení: vysoce specifický pro negativně nabité fosfohpidy prítomné ve vnejsi membráne bakterií a hub, agregace peptidů a tvorba pórů v membráně -lyže "buňky = destrukční účinek na membránu bakterií □ Účinný vůči širokému spektru mikroorganizmu □ Transformace genem pro MSI-99 □ Vysoká účinnost exprese, dostatečná ocjprana rostlin proti bakteriálním a houbovým patogenum Funkčnost antimikrobiálního proteinu MSI-99 u rostlin vůči patogenním mikroorganizmům Transgenní Netransgenní Tabák Rezistence k suchu □ Osmoprotektanta - nízkomolekulární látky regulující příjem a ~ zadržování vody * □ Trehalóza Gen 7PS7-Trehalózo-fosfát syntáza □ 25x vyšší akumulace trehalózy než při jaderné transformaci Tolerance k solím □ O s m o p rote kta n ta □ Glycin betain se akumuluje v některých rostlinách po působení sucha nebo pň vyšších koncentrací solí v půdě □ Gen badh - enzym betainaldehyd dehydrogenáza přeměňuje toxický betainaldehyd na netoxický glycin betain a (3-alanin betain □ Účinnost: transgenní rostliny mrkve rostou při 400 mM NaCI (úroveň halofyt) Transformed Transformed Untransformed Transformed Untransformed TRENDS in Biotechnology Fytoremediace Bezpečné a cenové efektívni odstraňovaní toxických chemikálií z prostredí pomoci pestovaní rostlin Rtuť Nejtoxičtější je organická rtuť Geny - pro bakteriální enzymy merA - reduktáza merB- lyáza Test pomocí vysoce toxického fenyl acetátu rtuti - PMA I WT 5A Transgenní rostliny rostou až do koncentrace 400 PMA. Plastidy jako bioreaktory farmakologických látek Lidský somatotropin □ Léčba trpasličího vzrůstu u dětí, Turnérova syndromu, chronického selhání ledvin □ Gen hST □ 7%tsp Albumin lidského séra □ Tvoří 60% proteinů krevního séra. Náhrada krve při traumatických stavech □ Gen HSA Antimikrobiální peptidy □ MSI-99 □ Efektivní i vůči lidským patogenům, efektivní i vůči bakteriím rezistentním k řadě léčiv (Pseudomonas aeruginosa) □ Po transformaci tabáku buněčný extrakt účinný vůči rezistentním bakteriím □ 21,5% tsp Lidský interferon □ Glykoprotein produkovaný bílými krvinkami jako odpověď na napadení organizmu virem. □ Funkce jako léčivo při virových infekcích, leukemii i proti nádorům (ledvin, kůže, sarkomu, malignímu lymfomu, mnohočetným myelomům aj.) □ Účinek - tlumí metabolismus některých buněk, tlumí projevy genů odpovědných za nádorovou přeměnu buňky □ Transgenní tabák Interferon a 19% tsp IFNa2b léčba leukemických buněk Interferon y 6% tsp Monoklonální protilátky □ Imunoglobuliny (Ig) □ Chrání tělo proti toxickým látkám a pronikajícím patogenům □ Protilátka Guy's 13 účinná vůči Streptococcus mutans □ psbA regulační sekvence + gen Guy 13 - exprese IgA-G Studium problematiky na začátku Výhoda - cena Bioreaktory pro vakcíny □ Vakcína cholery Gen - podjednotka toxinu cholery CTB(3 □ Vakcína antraxu □ Vakcína moru □ Zvířecí vakcíny - psí parvovirus Další příklady mimojaderné dědičnosti Symbiotické infekční částice □ 40. léta 20. st Tracy Sonneborn □ Symbiotické infekční částice kapa s vlastní DNA,100 až 200 na buňku □ Toxin paramecin - kmen killer □ Jaderný gen K determinuje odolnost k paramecinu □ Reprodukce - pohlavní výměna konjugací Mitotic division e e e e / / A Exchange and fusion V e es Meiosis of micronuclei \ \,_.. ' \____. Conjugates with 1 macronucleus and 2 micronuclei (2n) in each ! \ Two mitotic divisions / / e' e e e e e e e 6:9 6: 9 9 9 9 9 X Disintegration of 7 micronuclei and s macronucleus i in each « J * e e av V 1 macronucleus 8 micronuclei (n) in each Fusion of 2 micronuclei into / macronucleus l'ßä 1 remaining haploid micronucleus in each Many replications of macronucleus / DNA g-Q 0 > t e 2 haploid micronuclei in each 1 diploid micronucleus in each 4 diploid micronuclei in each 1 macronucleus 2 micronuclei (2n) in each Exconjugates Drosophila melanogaster □ Kmeny citlivé k C02 □ Virové částice sigma Drosophila bifasciata □ V potomstvu pouze dcery při 21°C a nizsich □ V cytoplazmě samiček symbiotický mikroorganizmus, letální pro samečky