SVĚTELNÁ A FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Mgr. Michal Franek Oddělení molekulární cytologie a cytometrie OSNOVA PŘEDNÁŠKY 1. Historie 2. Světelná mikroskopie a její modifikace 3. Fenomén fluorescence 4. GFP a Spinach 5. Konfokální fluorescenční mikroskopie 6. Imunocytochemické techniky, FISH, FRAP, FRET, live cell imaging 7. Superrezoluční fluorescenční mikroskopie Kdy vznikl první mikroskop? Robert Hooke, Micro-graphia, 1667, “Microscopium compositum” Antonie van Leeuwenhoek, Single-lens microscope, 200x magnification This is Hooke’s drawing of the microscopic structure of cork, showing in great detail the cell walls neatly separating the tiny sub-divisions of the plant. Until Hooke’s observations, the cellular structure of living matter was unknown. It was in fact Hooke who first used the word “cell,” likening what he saw through his microscope to a monk’s cell in a monastery. Pozorování buněk v microscopum compositum, R. Hooke http://archive.nlm.nih.gov/proj/ttp/flash/hooke/h ooke.html SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE 1.Pozorování ve světelném poli 2.Optické kontrastní metody 1. Fázový kontrast 2. Diferenciální interferenční kontrast 3.Pozorování v tmavém poli CHARAKTERISTIKA OBJEKTIVŮ – NUMERICKÁ APERTURA n = index lomu média Imerzní objektivy (zvětšení 60x – 100x); NA = 1,4 R = λ / 2NA Rozlišení, R, objektivu je definováno jako Bright-field microscopy http://www.olympusmicro.co m/primer/anatomy/bh2cutawa y.html Differential interference contrast microscopy http://www.leica-microsystems.com/science-lab/differential- interference-contrast-dic/ Phase contrast microscopy http://www.leica- microsystems.com/science- lab/the-principles-of-phase- contrast/ FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE FYZIKÁLNÍ PRINCIPY FLUORESCENCE STOKESŮV ZÁKON Vlnová délka emitovaného světla je vždy vyšší než vlnová délka excitačního světla (v důsledku ztráty energie elektronů při přechodu z vyšších excitovaných energetických hladin do nejnižšího stavu) λem > λex FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP A KONFOKÁLNÍ FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP Rozdíl mezi widefield a konfokální mikroskopií TYPY FLUOROFORŮ -> Aromatické organické sloučeniny (heterocykly, polyaromatické uhlovodíky) -> Proteiny (BFP, CFP, GFP, YFP, RFP, DsRed) -> RNA (Spinach) Ethidium bromid DAPI Texas Red ABSORPČNÍ A EMISNÍ SPEKTRA http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/fluorophoresintro.html Spinach – RNA mimic of GFP Spinach – RNA mimic of GFP NĚKTERÉ TECHNIKY MOLEKULÁRNÍ CYTOLOGIE 1. Imunocytochemie 2. Transfekce buněk 3. Indukce poškození DNA (indukce dvouřetězcových zlomů po senzitizaci, vnesení oxidativního poškození a fotoproduktů) 4. Studium dynamiky proteinů (FRAP) 5. Studium interakce proteinů (FRET) 6. Hybridizace in situ 7. Studium živých buněk (Live-cell imaging) IMUNOCYTOCHEMIE Vizualizace proteinů pomocí primárních a sekundárních protilátek. Primární nebo sekundární protilátka je značená fluoroforem (Alexa 488, Alexa 594, Cy3, Cy5…) PŘECHODNÁ TRANSFEKCE EUKARYONTNÍCH BUNĚK Různé komerční kity pro lipofekci Možnost elektroporace / nukleofekce obtížně transfekovatelných buněčných typů (embryonální kmenové buňky, quiescentní buňky) Optimální transfekce při 40-80% konfluenci Exprese proteinu neseného plazmidem zpravidla 24h – 48h po transfekci (závisí na délce buněčného cyklu konkrétní buněčné linie) http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10- 0826_transfection_tutorial_interactive.pdf Lipofekce Precipitace fosforečnanem vápenatým Transfekce dendrimery http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10- 0826_transfection_tutorial_interactive.pdf http://www.sigmaaldrich.com/materials-science/material- science-products.html?TablePage=16375655 http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10- 0826_transfection_tutorial_interactive.pdf INDUKCE POŠKOZENÍ DNA Metody fyzikální: A) Ozáření buněk γ zářením B) Ozáření buněk UV-lampou, UV-laserem Metody chemické a biologické: A) Využití mutagenů B) Využití vzácně štěpících restrikčních endonukleáz C) Generace cílených dsDNA zlomů pomocí CRISPR/Cas9 systému Cyklobutanové pyrimidinové dimery a 6’-4’ fotoprodukty Alkylované dusíkaté báze vzniklé působením alkylačních agens (EMS, MMS) Indukce dsDNA zlomů UV-laserem (355 nm) po senzitizaci buněk přidáním Brd-U / Hoechst 33342 FRAP – FLUORESCENCE RECOVERY AFTER PHOTOBLEACHING Photobleaching = fotochemická (ireverzibilní) destrukce fluoroforu Slouží ke sledování dynamiky proteinů značených fluoroforem FRET – FORSTER RESONANCE ENERGY TRANSFER Jedná se o nezářivý přenos energie mezi párem fluoroforů, donorem a akceptorem. Účinnost přenosu závisí na: 1. Překryvu emisního spektra donoru a absorpčního spektra akceptoru 2. Vzájemné orientaci dipólového momentu přechodu fluoroforů 3. Vzdálenosti fluoroforů (E ~ 1/r6) Účinnost přenosu (E) se vyjadřuje jako: FDA = Fluorescence donoru za přítomnosti akceptoru FD = Fluorescence donoru bez přítomnosti akceptoru VÝPOČET PŘEKRYVU SPEKTER DONORU A AKCEPTORU PRO FRET APLIKACE http://www.micro scopyu.com/tutori als/java/fluoresce nce/fpfret/index. html FRET – VYUŽITÍ Principles of Fluorescence Spectroscopy, J. R. Lakowicz, 2010 3D FISH FISH – Fluorescence in situ Hybridization LIVE CELL IMAGING Předpokladem pro vizualizaci živých buněk je inkubátor vestavěný do mikroskopu, který udržuje stabilní hladinu oxidu uhličitého (5 %) a teplotu (37 °C) Kultivační miska s mřížkou Nobelova cena za chemii 2014 : Objev superrezoluční fluorescenční mikroskopie Eric Betzig Stefan W. Hell William E. Moerner "The Nobel Prize in Chemistry 2014". Nobelprize.org. Nobel Media AB 2014. Web. 6 Nov 2014. PŘÍKLAD SUPERREZOLUČNÍ MIKROSKOPIE – STED (STIMULATED EMISSION DEPLETION)