qRT-PCR transfekce kryostat Mgr.Jiřina Medalová, Ph.D. Mgr. Pája Janovská RNDr. Joža Večeřa, Ph.D. jipro@sci.muni.cz po izolaci RNA ¢One step qRT-PCR (BFU) ¢ - kombinace syntézy prvního cDNA řetězce (reverzní transkripce) a PCR reakce ve stejné zkumavce ¢ + zjednodušení reakčního postupu a snížení rizika kontaminace ¢ + rychlejší zpracování velkého množství vzorků ¢ + díky tomu, že se amplifikují všechny mRNA (cDNA) dosáhneme ¢ vyšší senzitivity (stačí i 0.01 pg celkové RNA) ¢ - možné použít jen „sequence-specific“ primery ¢ - celá reakce je použita pro jedno PCR, nemožnost opakování ¢ ¢Two step qRT-PCR (OFIŽ) ¢ - nejprve se provádí reverzní transkripce z celkové RNA pomocí oligo dT primeru za vzniku cDNA (do reakce vstupuje 1 ug celkové RNA) ¢ - PCR probíhá v nových zkumavkách (do reakce vstupuje 1,5 ul cDNA z přepisu) ¢ + z jednoho přepisu je možné provést cca 25 PCR reakcí (různé primery) ¢ + možnost optimalizovat PCR s použitím různých polymeráz, primerů atp. ¢ + srovnání exprese různých genů na stejném vzorku ¢ - vyšší riziko kontaminace ¢ - více pipetovacích kroků ¢ zpětný přepis do cDNA 1. Změření koncentrace vyizolované RNA (Nanodrop) + kontrola kvality RNA - absorbance A260 nesmí být vyšší než 1 (případně ředit a měřit znova) - poměr absorbancí A260/280 musí být kolem 2 2. Spočítat kolik ul RNA je 1 ug, který vstupuje do RT 22.92 ng/ul … x10=229.2 ng/ul 229.2 ng …. 1 ul 1000 ng …. x ul (4,36 ul) 3. Doředit do 16 ul sterilní RNase-free MQ H2O 4. Přidat 2 ul 10 uM směsi nukleotidů (PCR grade)… ??? WS 5. Přidat 2 ul 20 uM primeru poly(dT)15 … ??? WS 6. Mix – C – annealing primerů 10 min/37°C – přenos na 4°C 7. Přidat 4 ul 10xcc pufru pro traskriptázu s 0.1 M DTT (zrušení disulfidových můstků) 8. Přidat 2 ul reverzní transkriptázy (např. M-MLV - Moloney Murine Leukemia Virus) 9. Přidat 14 ul sterilní RNase-free MQ H2O Celkový objem 40 ul 10. Inkubace 50 min/37°C pak denaturace transkriptázy 10 min/90°C 40 ul…. 10 uM 2 ul….. 0.5 uM Sample ID User ID Date Time ng/ul A260 A280 260/280 260/230 K Default 2/24/2010 16:33 PM 22.92 0.573 0.288 1.99 0.50 APO Default 2/24/2010 16:34 PM 26.56 0.664 0.327 2.03 0.57 ROS Default 2/24/2010 16:35 PM 15.11 0.378 0.201 1.88 0.69 CAM Default 2/24/2010 16:36 PM 20.01 0.500 0.247 2.02 0.63 DOX Default 2/24/2010 16:37 PM 5.48 0.137 0.072 1.91 0.19 GELD Default 2/24/2010 16:38 PM 10.92 0.273 0.126 2.17 0.42 ETO Default 2/24/2010 16:38 PM 11.31 0.283 0.150 1.89 0.34 <1 =2 A260… RNA A280… DNA A230… proteiny 10x ředěný vzorek RNA Příklad výstupu z Nanodropu Real time PCR ¢LightCycler 480 (Roche) ¢Do reakce se přidává Sybr Green (fluoreskuje jen po interkalaci do nově vytvořené DNA) ¢Po každém cyklu se změří fluorescence vzorku ¢Čím vyšší fluorescence, tím více produktu vzniklo ¢Čím více molekul cDNA ve vstupu, tím dříve se začíná množit exponenciální řadou (dřívější cyklus – výstupní parametr Cp) ¢Master mix: 1,5 ul cDNA z přepisu + •10 ul Sybr Green (2xcc LighCycler 480 SYBR green I master kit) •0,33 uM každého z primerů (SS 20 mM…. ??? ul) •Doředit do 18,5 ul sterilní RNase-free MQ H2O (celkový objem 20 ul) ¢ chart_fluorescence http://www.youtube.com/watch?v=3H9oabhqDAc http://www.youtube.com/watch?v=HU6GUGvDLeg Příklad výstupu result3 Získání hodnoty Cp: 1) fit pointy manuálně 2) pomocí 2. derivace automaticky There are two methods for determining the cycle-threshold value; one method, namely fit point, is performed by drawing a line parallel to the x-axis of the real-time fluorescence intensity curve (Ct) [8]. The second, namely second derivative, calculates the fractional cycle where the second derivative of the real-time fluorescence intensity curve reaches the maximum value (Cp) [9]. Ověření specifity reakce PEBVFigure5 OK KO melting curve Vyhodnocení qRT-PCR DCp Name Cp průměr GAPDH C1-GAPDH 2^-DCp F16 K3 31,84 31,43 31,635 36,39 -4,755 27,0021 F16 LY3 32,17 33,18 32,675 36,985 -4,31 19,8353 F16 K6 32,25 32,13 32,19 35,225 -3,035 8,1965 F16 LY6 31,83 31,84 31,835 34,97 -3,135 8,7847 F16 K9 31,16 31,01 31,085 36,34 -5,255 38,1867 Transfekce ¢Přenos cizorodé DNA pomocí klonovacích vektorů ¢Vektory - molekuly DNA do nichž je včleněn gen zájmu ¢Nejčastěji se používají plazmidy - malé bakteriální kruhové molekuly DNA 00192l http://2009.igem.org/wiki/images/1/17/HD09_p31.png Nejčastější metody transfekce ¢Směs negativně nabitého Ca(H2PO4)2 a pozitivně nabitého CaCl2 tvoří precipitát, do kterého se naváže DNA ¢Kationické polymery DEAE-dextran, polyetylenimin (PEI) – negativně nabitá DNA se naváže na polykation a endocytózou se přenese do buněk ¢Liposomy (lipofectamin) – DNA je obalena lipidovou kapsulkou, která může fúzovat s membránou ¢Fugene – neznámé složení neliposomálního typu, etanol ¢Elektroporace – vytvoření pórů (Neon) lNukleofekce – kombinace elektroporace a dalších činidel ¢ ¢Krevní buňky je možné transfekovat jen elektroporací Plusy a mínusy ¢PEI l+ cena/efektivita l- nutnost výměny média (toxicita) ¢Lipofectamine l+ efektivita l- nutnost výměny média, cena ¢NEON l+ efektivita, není nutno měnit médium, použití na krevní buňky l- cena ¢Fugene l+ efektivita, není nutno měnit médium l- cena l ¢ ¢ https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/prodImages/high/TransfectSystKit.JPG Odhad účinnosti transfekce GFP mol_bi3 Kvantitativní vyhodnocení účinnosti transfekce GFP ¢Pomocí trypsin/EDTA uvolnit buňky do suspenze ¢Změřit zelenou fluorescenci (kanál F1) průtokovým cytometrem Accuri C6 File:HD09 GFP positive HeLa Jet.png www.odont.uio.no Výhody kryořezů: •Rychlá příprava vzorků, umožňující provést detekci proteinů i během operace •Zachování enzymatické aktivity i antigenicity •Zachycení látek, které se standardní technikou rozpustí (lipidy) •Zachování buněčné morfologie (není třeba chemické ani tepelné modifikace) •Může se provést nefixovaných i nefixovaných vzorcích tkání Nevýhoda: nižší kvalita preparátů Kryostat Příprava vzorků: Zalití do OCT (polyethylen glykol + polyvinyl alkohol) Zamražení tkáně v -80°C Krájení řezů v kryostatu (mikrotom v chladné komoře) -20 až -30°C Složení mrazící směsi: 44% - pentafluoroethane, 52% - trifluoroethane, 4% - tetrafluoroethane