*Metabolizmus – souhrn všech enzymatických reakcí přeměny živin a energie v živé buňce. Metabolické děje nefungují náhodně a neřízeně. * * * * *Buňka je otevřený systém charakteristický výměnou hmoty, energie a informace se svým prostředím: * *živiny z prostředí *↓ *buňka (transformace živin – tvorba energie, syntéza biomolekul) *↓ *exkrece metabolitů *Tok hmoty, energie a informace buňkou = metabolizmus * *Katabolizmus - degradativní procesy, vedoucí ke tvorbě energie (-ΔG) *Anabolizmus – syntetické pochody spojené se spotřebou energie (+ΔG) * *Katabolizmus a anabolizmus jsou dva protichůdné procesy, které vedle sebe existují v prostoru a čase a vzájemně se podmiňují. * * * * * * * *Proces metabolizmu je souhrn biochemických reakcí, které * a/ probíhají posloupně a jsou “seřazeny“ do řad – metabolické dráhy * b/ uzavřeny do kruhu – cykly *Výsledný metabolit může vznikat více než jednou metabolickou drahou - alternativní metabolické dráhy * * * *Každá metabolická dráha – metabolický pochod – je řízen specifickým regulačním systémem *Regulační systém se uplatňuje * - již při syntéze enzymů * - nebo má vliv na aktivitu enzymu * *Bakteriální buňka má schopnost regulovat děje, které v ní probíhají – metabolické procesy jsou regulované. *Buňka sleduje hodnoty veličin v prostředí (v médiu) a reaguje na ně adaptací. *Hlavní cíl buňky – přežít a pomnožit se. *Metabolické reakce (dráhy, cykly) jsou regulovány ("vypínány a zapínány") tak, aby to pro buňku bylo ekonomicky výhodné. * * * * *Příklad represe enzymů anaerobního metabolizmu kyslíkem *Způsob využívání glukózy u E. coli: -aerobní respirace -anaerobní respirace nitrátem -fermentace *Kyslík u fakultativně anaerobních bakterií inhibuje fermentaci i anaerobní respiraci – na úrovni represe syntézy enzymů (terminální nitrátreduktázy; i v přítomnosti induktoru-nitrátu) i na úrovni inhibice aktivity již vytvořeného nitrátreduktázového systému. *= kyslíkový efekt * *Přítomnost kyslíku u fakultativních anaerobů inhibuje nejen fermentaci, ale i anaerobní respiraci (nitrátu, tetrationátu, fumarátu) *Anaerobní respirace probíhající paralelně s respirací kyslíkem by byla pro buňku neekonomická – kyslík má ze všech akceptorů elektronů nejkladnější elektrodový potenciál → největší změna volné energie oxidací kyslíkem *Kyslík inhibuje syntézu enzymů anaerobního metabolizmu (např. nitrátreduktázy, fumarátreduktázy, alkoholdehydrogenázy) a zároveň indukuje syntézu enzymů aerobního metabolizmu (NADH-oxidázový systém, malátdehydrogenáza) * *Kyslík *→ inhibitor syntézy enzymů anaerobního metabolizmu * (např. nitrátreduktázy, alkoholdehydrogenázy) *→ induktor syntézy enzymů aerobního metabolizmu * (NADH-oxidázový systém, malátdehydrogenáza) * *Nepřítomnost kyslíku, přítomnost nitrátu (a schopnost bakterie anaerobně respirovat) *→ indukce nitrátreduktázy *→ inhibice syntézy enzymů zapojených do fermentace *Přítomnost dvou substrátů v prostředí – (např. glukóza vs. laktóza) – buňka dá přednost energeticky výhodnějšímu substrátu (glukóza). * *Glukóza jako výhodnější substrát vyvolá represi enzymů, které jsou nutné pro využívání méně výhodné laktózy → diauxický tvar růstové křivky (glukózový efekt, katabolická represe). * *Podstatou Pasteurova efektu je alosterická inhibice a aktivace klíčových enzymů glykolýzy -zavedení kyslíku do anaerobně metabolizujících buněk vede ke zpomalení kvašení a zpomalení spotřeby cukru a zrychlení růstu kultury. -za anaerobních podmínek spotřebují buňky více sacharidů než aerobně *Pasteurův efekt reguluje rychlost glykolýzy podle rychlosti spotřeby jejích produktů (ATP a stavebních bloků) anabolizmem. *Ekonomické hospodaření buňky → rychlost glykolýzy je zpomalována při přechodu z anaerobních podmínek (fermentace) do podmínek aerobních (aerobní respirace). * *ATP – centrální role v metabolizmu buňky. *AMP a ADP jsou molekulárními efektory, které pozitivně ovlivňují některé enzymy podílející se na tvorbě ATP (=alosterická aktivace enzymu), např. fosfofruktokinázu (ADP a AMP), pyruvátkinázu (AMP) v dráze glykolýzy. *Mechanizmus účinku efektorů: alosterická modifikace enzymů a ovlivnění rychlosti enzymové reakce (koncentrací ATP, ADP a AMP, tj. substrátu). * * *Klíčovou reakcí glykolýzy je fosforylace fruktóza-6-fosfát na fruktóza-1,6-difosfát – katalyzovaná enzymem fosfofruktokinázou *1. Fosfofruktokináza – aktivována ADP a AMP (signál nedostatku ATP), inhibována fosfoenolpyruvátem (zpětná vazba) *Hromadění fruktóza-1,6-difosfátu → aktivace syntézy glykogenu a aktivace syntézy oxalacetátu (zrychlení Krebsova cyklu), aktivace pyruvátkinázy (tj. posledního enzymu sekvence) * *2. Pyruvátkináza – aktivována fruktóza-1,6-difosfátem a vysokou koncentrací AMP (signál nedostatku ATP) * *3. Citrátsyntáza – aktivována AMP, inhibována α-ketoglutarátem a vysokou koncentrací NADH *Hromadění acetyl-CoA v buňce → aktivace syntézy oxalacetátu (zrychlení Krebsova cyklu) * * * * *naskenovat obr. ze skript (299 mal.kapr) C:\Users\matoulkova\Documents\Scan0008.jpg Fosfofruktokináza – aktivována ADP a AMP (signál nedostatku ATP), inhibována PEP (zpětná vazba) Pyruvátkináza – aktivována fruktóza-1,6-difosfátem a vysokou koncentrací AMP (signál nedostatku ATP) Citrátsyntáza – aktivována AMP, inhibována α-ketoglutarátem a vysokou koncentrací NADH *Poměr ATP, ADP a AMP v buňce je klíčovým regulačním efektorem udržujícím poměr katabolických a anabolických reakcí takový, aby to pro buňku bylo výhodné. * *Klíčový regulátor: *EN=energetický náboj buňky * *EN může teoreticky nabývat hodnot od 0 (jen AMP) do 1 (jen ATP). *Ve skutečnosti je v rostoucí buňce EN=0,85, i za různých fyziologických podmínek. *Hodnota EN=0,85 odpovídá ustálenému stavu, kdy je rychlost reakcí generujících ATP rovna rychlosti reakcí spotřebovávajících ATP. *Nižší hodnoty EN byly zjištěny u hynoucích buněk. * *Regulace metabolizmu *– realizována KOMBINACÍ nebo SUPERPOZICÍ různých mechanizmů *Regulace metabolizmu = regulace syntézy a aktivity enzymů. * *Regulace syntézy enzymů: *Regulace indukcí - zejména u katabolických drah → syntetizovány jsou pouze enzymy potřebné pro utilizaci přítomného substrátu. *Represe – zejména u anabolických drah → enzymy, jejichž produkty jsou v dané době dostupné z prostředí, nejsou buňkou syntetizovány. * *Regulace aktivity enzymů: *Zvýšení katalytické aktivity enzymu – působením pozitivní efektorové molekuly (pozitivního efektoru) *Snížení katalytické aktivity enzymu – vlivem negativního efektoru * *Rychlost enzymové reakce – je dána 1)koncentrací substrátu 2)koncentrací enzymu * *Změna koncentrace substrátu má jen malý vliv na rychlost metabolických drah (homeostáza metabolického systému). *→ rychlost enzymové reakce je přímo úměrná koncentraci enzymu (jeho aktivní formy) *Regulace aktivity enzymu - změnou koncentrace aktivní formy enzymu. *Změna koncentrace enzymu je hlavní nástroj regulace metabolizmu. * * * * * *REGULACE AKTIVITY ENZYMŮ *Koncentrace enzymu v buňce může být regulována několika způsoby: 1.inaktivací / aktivací přítomných molekul enzymu * - alosterická interakce s metabolitem (zpětná vazba) * - kovalentní chemická modifikace * 2.- změnou rychlosti syntézy enzymu * - změnou rychlosti degradace enzymu * *Bakteriální buňka rostoucí v minerálním médiu syntetizuje všechny aminokyseliny (každou z nich) podle své potřeby – žádná se v buňce nehromadí. *Konečný produkt metabolické dráhy specificky inhibuje aktivitu enzymu katalyzujícího první reakci v této dráze = inhibice zpětnou vazbou ("feedback inhibition"). *Např. tryptofan specificky inhibuje aktivitu enzymu syntetizujícího jeden z jeho prekurzorů. * *Látka inhibující aktivitu enzymu se strukturně nepodobá ani substrátu ani produktu inhibovaného enzymu – nemůže se tedy vázat na aktivní místo enzymu. *Enzymy vykazující zpětnovazebnou inhibici, mají jedno specifické vazebné místo navíc – místo regulační – pro reverzibilní nekovalentní navázání metabolitu - efektorové molekuly (→ alosterické enzymy). * *Regulace aktivity alosterických enzymů *= alosterická inhibice / alosterická aktivace. * Vazba efektorové molekuly na regulační místo enzymu ↓ změna konformace enzymu = změna vazebného místa pro substrát ↓ aktivace/ inaktivace enzymu Alosterický enzym *Alosterická inhibice – vazbou efektorové molekuly (negativního modulátoru) na regulační místo enzymu → změna vazebného místa pro substrát → enzym se stává inaktivní. * Alosterická aktivace – vazba pozitivního modulátoru na regulační místo → změna vazebného místa pro substrát → aktivace enzymu. Alosterické enzymy se vyskytují ve dvou konfiguracích – aktivní nebo inaktivní. Regulace biosyntézy tryptofanu první enzym dráhy (antranilát syntáza) je regulován na principu zpětné vazby tryptofanem. Nadbytek izoleucinu v prostředí inhibuje aktivitu prvního enzymu v dráze své biosyntézy. Aktivní forma enzymu Inaktivní forma enzymu (změna konformace) Inhibice zpětnou vazbou *Regulace rozvětvených metabolických drah – musí být zajištěno, aby přítomnost jednoho ze dvou konečných produktů nezastavila syntézu i toho druhého. *Syntéza aminokyselin de novo – regulovaný proces * * * * *→ např. nadbytek prolinu nezastaví syntézu argininu (společný prekurzor je glutamát) * * * * * * *- sekvenční inhibice zpětnou vazbou – každý z konečných produktů zpětnovazebně inhibuje sebe sama "za větvením" a zároveň jejich společný prekurzor inhibuje aktivitu prvního enzymu metabolické sekvence. * *Alosterická regulace aktivity enzymů – umožňuje okamžitou reakci buňky na změnu prostředí, snadnou reverzibilitu, bez spotřeby energie. * *Regulace aktivity enzymů kovalentní modifikací – mechanizmus zesílení regulačního signálu, regulační stav zůstává zachován i poté, co příčina pominula – pro jeho zrušení je potřeba opačně působící efektorová molekula. -fosforylace / defosforylace -adenylace / deadenylace -ADP-ribozylace -oxidace a redukce tiolových skupin (SH / SS) *Fosforylace a defosforylace -aktivace fosforylací - např. pyruvátkináza -aktivace defosforylací – např. pyruvátdekarboxyláza - * * * *Fosforylace probíhá za spotřeby ATP (kinázami), defosforylace za odštěpení anorganického fosfátu (fosfatázami). *Tento systém regulace umožňuje zesilovat chemický signál – jedna molekula kinázy katalyzuje aktivaci tisíců molekul enzymu. * *Adenylace / deadenylace *např. regulace glutaminsyntetázy E. coli -zajišťuje vstup NH3 z prostředí do metabolizmu buňky při nízkých koncentracích NH3 v médiu (fixace amoniaku bakteriální buňkou) -GS se v buňce vyskytuje ve dvou formách – aktivní (deadenylované; v nepřítomnosti NH4+ v médiu) a neaktivní (adenylované; v přítomnosti NH4+ v médiu). -Aktivaci a inaktivaci provádí enzym adenylyltransferáza (ATáza) *Protein PII – "rozhoduje" o tom, zda proběhne adenylace (inaktivace) nebo deadenylace (aktivace) glutaminsyntetázy. *Protein PII se vyskytuje ve dvou formách: -základní deuridylovaná forma → stimulace adenylace (inaktivaci GS) -uridylovaná forma → stimulace deadenylace (aktivaci GS) *Kovalentní uridylaci (přenos UMP z UTP) katalyzuje uridyltransferáza (UT-áza), deuridylaci UR-áza. * *Metabolické efektory (alosterická regulace UT-ázy a UR-ázy): *α-oxoglutarát, ATP – přítomny v buňce při dostatku zdroje uhlíku a energie a nedostatku NH3 → aktivace glutaminsyntetázy *glutamin – inaktivace GS (stimulace adenylační aktivity ATázy) * *Výhody chemické modifikace enzymu *→ zařízení pro zesílení regulačního signálu -jedna molekula regulujícího enzymu (ATázy) katalyzuje transformaci tisíců molekul regulovaného enzymu (glutaminsyntetázy) -jedna molekula regulovaného enzymu (glutaminsyntetázy) katalyzuje přeměnu tisíců molekul substrátu - *Ve srovnání s alosterickou regulací zůstává při regulaci kovalentní modifikací navozený regulační stav i poté, co signál odezněl - návrat do původního stavu vyžaduje nový opačný signál. * * * * *REGULACE RYCHLOSTI SYNTÉZY ENZYMŮ *Hlavní nástroj adaptace rostoucí buňky na změnu podmínek prostředí – zapínání a vypínání genů, regulace jejich exprese. *Regulace rychlosti syntézy enzymu = regulace rychlosti genové exprese – probíhá na třech úrovních: *- na úrovni transkripce *- na úrovni translace * -na posttranslační úrovni 1) *Hlavní úrovní je regulace transkripce – regulace v prvním kroku operačního sledu. * *Transkripce – proces přepisu sekvence DNA do sekvence funkčních RNA (tRNA, rRNA, mRNA) * *Transkripce – syntéza molekul RNA za účasti RNA-polymerázy: *Iniciace – vazba RNA-polymerázy na promotor (prostřednictvím σ-faktor u) *Elongace – vlastní syntéza molekul RNA (rychlost 40-80 nukleotidů/s) *Terminace – ukončení syntézy (specifická báze na přepisovaném řetězci DNA) * *Regulována je frekvence iniciace transkripce (rychlost elongace je konstantní). * * *Transkripce – přesně kontrolovaný a regulovaný proces: -regulace rychlosti syntézy všech forem RNA -regulace frekvence iniciace transkripce genů/operonů * * * *Bakteriální chromozom je členěn na funkční jednotky – operony – jejichž transkripcí vzniká jedna molekula mRNA. * * * * * *Promotor a operátor – regulační úseky operonu. *Regulátorový gen – kóduje bílkovinu (represor), která se váže na operátor a brání nasednutí RNA-polymerázy na promotor. * *Laktózový operon E. coli – obsahuje 3 strukturní geny kódující 𝛃-galaktozidázu, permeázu a acetylázu. * Operon může obsahovat jeden nebo více genů kódujících enzymy -enzymy účinkující ve společném metabolickém ději *Možnosti regulace rychlosti syntézy enzymu na úrovni transkripce: * 1)Modifikace RNA-polymerázy 2)Variace v promotoru 3)Negativní regulace represorem na operátoru (indukce a represe) 4)Pozitivní regulace na promotoru 5)Atenuace * * *Podjednotka RNA-polymerázy 𝛔-faktor (sigma faktor) je zodpovědná za iniciaci transkripce – "vyhledává" na DNA promotory a určuje tak, které operony budou přepisovány. * -změna σ-faktoru RNA-polymerázy nastává např. při sporulaci (σ-faktor určuje, jaké operony budou přepisovány) -k výměně σ-faktoru dochází při změně podmínek prostředí (stresové podmínky – chladový šok, hladovění atd.) -syntézu nových σ-faktorů může vyvolat např. infekce buňky bakteriofágem -různé organizmy mohou syntetizovat různé σ-faktory (např. E. coli - 7, Bacillus subtilis - 14) -σ-faktor rozhoduje o tom, které promotory na DNA mají být činné a a které mlčící (případně v součinnosti další specifické bílkoviny – regulace katabolickou represí) -nejde o plynulou regulaci metabolizmu vegetativně rostoucích buněk - *Možnosti regulace rychlosti syntézy enzymu na úrovni transkripce: * 1)Modifikace RNA-polymerázy 2)Variace v promotoru 3)Negativní regulace represorem na operátoru (indukce a represe) 4)Pozitivní regulace na promotoru 5)Atenuace * * *Promotor – regulační oblast na DNA, předchází strukturnímu genu/operonu; úsek bohatý na AT páry *Odchylky v primární struktuře promotorů určují rozdíly v afinitě σ-faktoru (a tedy i RNA-polymerázy) k jednotlivým promotorům. * * * * * * * * *Nejzákladnější způsob regulace genové exprese v bakteriální buňce. * * sekvence bází promotorů rozeznávaných daným σ-faktorem jsou si velmi podobné, ale ne zcela identické *↓ *afinita RNA-polymerázy k různým promotorům je různá *(promotory jsou různě "silné") *↓ *různá frekvence iniciace transkripce různých genů/operonů *↓ *různá hladina mRNA v buňce *↓ *různá hladina různých proteinů v buňce *– odlišnost sekvencí promotoru je příčinou rozdílné frekvence iniciace transkripce *Tento způsob regulace se týká zejména: -syntézy konstitutivních enzymů (represorem a operátorem neregulovaných), které jsou v buňce syntetizovány nezávisle na podmínkách prostředí, např. většina enzymů glykolýzy -rychlosti syntézy represorů (regulátorových genů) -některých enzymů, které buňka potřebuje ve velmi nízkých koncentracích * *Možnosti regulace rychlosti syntézy enzymu na úrovni transkripce: * 1)Modifikace RNA-polymerázy 2)Variace v promotoru 3)Negativní regulace represorem na operátoru (indukce a represe) 4)Pozitivní regulace na promotoru 5)Atenuace * * *Represory – alosterické bílkoviny, produkty regulátorového genu. Mají vazebné místo pro efektor (→ změna konformace represoru) *Tímto systémem probíhají dva základní regulační děje: *A) Indukce syntézy enzymu v přítomnosti substrátu *- tímto způsobem je kontrolována syntéza různých enzymů tvořících se jen v přítomnosti specifických substrátů katabolických drah *B) Represe syntézy enzymu konečným produktem *- způsob regulace používaný ke kontrole syntézy enzymů anabolických drah – enzymy jsou syntetizované jen tehdy, není-li produkt dané dráhy k dispozici hotový v prostředí. * *- tímto způsobem je kontrolována syntéza různých enzymů tvořících se jen v přítomnosti specifických substrátů (katabolické dráhy) -transkripce laktózového operonu je indukována přítomností laktózy -laktóza (=induktor) se naváže na represor, * → změna konformace represoru * → uvolnění represoru z operátoru * → nasednutí RNA-polymerázy na promotor * → transkripce operonu * * *Laktózový operon E. coli – obsahuje 3 strukturní geny kódující enzymy potřebné pro vstup laktózy do metabolizmu: 𝛃-galaktozidázu, permeázu a transacetylázu. * *V nepřítomnosti laktózy: *– represor inhibuje transkripci operonu *- koncentrace 𝛃-galaktozidázy a permeázy v buňce je velice nízká (množství je dostatečné pro transport a štěpení některých molekul laktózy, pokud je přidána do média). - * *Přídavek laktózy do média: *→ laktóza je transportována permeázou do buňky a přeměněna na izomer allolaktózu (transglykozylací), která se naváže na lac-represoru. *→ represor změní svou konformaci a uvolní se z DNA. *→ RNA-polymeráza může nasednout na promotor a zahájit transkripci *→ množství 𝛃-galaktozidázy v buňce se může zvýšit až 1000x * * -způsob regulace používaný ke kontrole syntézy enzymů anabolických drah - * → enzymy jsou syntetizované jen tehdy, není-li produkt dané dráhy k dispozici hotový v prostředí * -Např. histidinový operon Salmonella typhimurium kóduje 9 enzymů dráhy syntézy histidinu z 5-fosforibozyldifosfátu *- při nadbytku histidinu se zastaví tvorba enzymů katalyzujících jeho syntézu (ta se obnoví při poklesu koncentrace histidinu pod kritické množství); histidin = korepresor *V nepřítomnosti histidinu: *- operon je přepisován (represor sám o sobě nemá afinitu k operátoru a neváže se na něj) *V přítomnosti histidinu v médiu: * → histidin se naváže na represor * → změna konformace represoru * → represor s navázaným histidinem má vysokou afinitu k operátoru, naváže se na něj * → zablokování iniciace transkripce * *Možnosti regulace rychlosti syntézy enzymu na úrovni transkripce: * 1)Modifikace RNA-polymerázy 2)Variace v promotoru 3)Negativní regulace represorem na operátoru (indukce a represe) 4)Pozitivní regulace na promotoru 5)Atenuace * * *Některé promotory vyžadují pro nasednutí RNA-polymerázy a iniciaci transkripce přítomnost specifického proteinu – regulačního proteinu. *Týž regulační protein může pozitivně regulovat iniciaci transkripce různých promotorů. *Pozitivně regulovaný promotor (např. lac-promotor) * *CAP-protein (catabolite activator protein) – regulační protein, získá afinitu k promotoru až po vazbě cAMP. *CAP s navázaným cAMP umožní iniciaci transkripce operonu řízeného pozitivně regulovaným promotorem. *- glukóza (resp. produkty jejího rozkladu) inhibuje syntézu cAMP * *Katabolická represe → v přítomnosti glukózy není indukována syntéza enzymů kódovaných lac-operonem, přestože laktóza (induktor) je v prostředí přítomna -v buňce "chybí" cAMP, který by se navázal na CAP protein a byla zahájena transkripce operonu. *Lac-promotor je regulovaný pozitivně i negativně. - * * *K transkripci laktózového operonu je nutný komplex CAP a cAMP a přítomnost laktózy jako induktoru. *V přítomnosti glukózy transkripce laktózového operonu neprobíhá ani za přítomnosti induktoru (laktózy), protože se netvoří cAMP. * *→ laktózový operon je regulován pozitivně i negativně * *→ katabolická represe je nadřazena procesu indukce * Transkripce blokovaná represorem Transkripce probíhá minimálně – katabolická represe Transkripce probíhá - represor neblokuje operátor, CAP s navázaným cAMP pozitivně reguluje promotor - * * *Glukózový efekt - přítomnost glukózy v médiu blokuje tvorbu enzymu zpracovávajícího druhý cukr, přestože je tento druhý cukr také přítomen. *Příkladem takového enzymu (tj. glukózo-senzitivního) je 𝛃-galaktozidáza, inducibilní enzym štěpící laktózu na glukózu a galaktózu. *Glukózosenzitivní enzymy - přeměňují substráty na metabolity, které může buňka získat mnohem rychleji metabolizmem glukózy. * *DIAUXIE - důsledek regulačních dějů zajišťujících ekonomické hospodaření buňky v přítomnosti dvou živin se stejnou funkcí. *V přítomnosti glukózy a laktózy buňka netvoří 𝛃-galaktozidázu, enzym katabolizující laktózu (katabolická represe) – potřeby buňky jsou saturovány katabolizmem glukózy. * * *Po vyčerpání glukózy z média stoupne hladina cAMP v buňce → cAMP aktivuje CAP protein (alosterická aktivace) → iniciace transkripce lac-operonu (pozitivní regulace promotoru)→ utilizace laktózy * *Katabolická represe (glukózou) je nadřazena procesu indukce syntézy enzymu (𝛃-galaktozidázy) i v přítomnosti jeho substrátu (laktóza). *Glukózový efekt je příkladem obecnějšího jevu – schopnosti buňky vybírat si ten nejvýhodnější substrát. *Katabolická represe – některé promotory vyžadují pro zahájení transkripce (resp. nasednutí RNA-polymerázy) přítomnost specifického proteinu (CAP-protein, CRP-protein = cAMP receptor protein). *Ten se na promotor může navázat jedině v aktivované formě, tj. po navázání cAMP (alosterická aktivace). * *Hladinu cAMP v buňce určuje membránový enzym adenylátcykláza, jehož aktivita je inhibována transportem glukózy do buňky → cAMP se netvoří, a neexprimují se na něm závislé promotory. * *cAMP – univerzální biologická regulační molekula *(u prokaryot i eukaryot) *kontroluje syntézu některých bakteriálních enzymů -lac-operonu -gal-operonu -luciferázy -flagelinu.... *a řadu buněčných procesů: -chemotaxe, oxidační fosforylace ... *Možnosti regulace rychlosti syntézy enzymu na úrovni transkripce: * 1)Modifikace RNA-polymerázy 2)Variace v promotoru 3)Negativní regulace represorem na operátoru (indukce a represe) 4)Pozitivní regulace na promotoru 5)Atenuace * * *Tryptofanový operon řídí syntézu pěti enzymů potřebných k tvorbě tryptofanu z chorizmátu. *Represor tryptofanového operonu se může navázat na operátor teprve v komplexu s korepresorem (=tryptofan). *↓ *vysoká afinita komplexu k operátoru *↓ *signál pro zastavení transkripce *Atenuace = způsob regulace transkripce operonu podmíněný přítomností atenuátoru *Atenuátor je úsek DNA mezi operátorem a genem pro první ze skupiny enzymů, ve vedoucí DNA sekvenci, která obsahuje úsek fungující jako předčasný terminátor transkripce. * * * * * * * * *Tryptofanový operon * *atenuátor tvořen šesti obrácenými repeticemi *↓ *mohou se spárovat do vlásenek tří typů: *↓ ↓ ↓ * vlásenka 3 a 4 preemptor (při nedostatku TRP je zabráněno tvorbě terminátorové vlásenky), transkripce pokračuje vlásenka 5 a 6 terminátor transkripce (za nadbytku TRP ) transkripce se zastaví vlásenka 1 a 2 protektor (při zastavení translace) transkripce se zastaví *Nadbytek tryptofanu: *- Trp-tRNA se vážou na kodony pro tryptofan (v sekvenci 1) -ribozom projde přes sekvence 2 a 3 a zastaví se -vytvoří se terminátorová vlásenka, ukončí se transkripce - *Nedostatek tryptofanu: -na kodony pro tryptofan se neváže žádná Trp-tRNA (kodony tedy působí jako terminační) -ribozom se zastaví na sekvenci 1 a 2 a může tak vzniknout vlásenka 3 a 4 (preemptor) -transkripce pokračuje, tvoří se mRNA pro syntézu tryptofanu * *Při zastavení translace: -vytvoří se protektorová vlásenka -preemptorová už se nemůže vytvořit -vytvoří se terminátorová a transkripce se zastaví * * *Regulace na úrovni translace a na posttranslační úrovni *Translace u bakterií navazuje těsně na transkripci – ribozom nasedá na mRNA hned jakmile je přítomen iniciační signál – vazebné místo pro ribozom *Vyšší rychlosti proteosyntézy lze dosáhnout větším počtem ribozomů a častější iniciací translace *Na polycistronické mRNA – afinita vazebného místa různá pro různé strukturní geny → různá rychlost iniciace translace pro různé geny na téže mRNA *Lac-operon: -iniciace translace úseku mRNA pro 𝛃-galaktozidázu každé 3,2 sekundy -pro acetyltransferázu na téže molekule mRNA každých 16,6 sekundy -kovalentní modifikace enzymů (fosforylace, glykozylace) -agregace neaktivních podjednotek proteinu ve funkční oligomerní enzym -tvorba supramolekulárních komplexů s jinými enzymy (respirační řetězec) *Životnost enzymové molekuly je omezená – různá u různých proteinů a za různých fyziologických podmínek. *Změna rychlosti degradace enzymu je jako regulační mechanizmus používána jen v případech enzymové přestavby buňky: -při sporulaci, klíčení endospor -při hladovění buněk na některou nepostradatelnou živinu (při přechodu do stacionární fáze růstu) -při zásadní změně podmínek prostředí (změna zdroje uhlíku a energie, přechod z heterotrofie na autotrofii) *Degradace probíhá i na úrovni primárního transkriptu. *Mechanizmus selektivní degradace enzymů není znám.