Měření schopnosti kvasinek flokulovat Doplnění laboratorního cvičení z Fyziologie bakterií Řešitelé: Kopecká Jana, Sedláček Ivo, Balážová Tereza showImage Koláž piv •Kvasinky • •heterotrofní eukaryotní organismy • •netvoří jednotnou taxonomickou skupinu (asko-, basidio-, deuteromycety) • •dle Grama se barví jako G+, ale buněčná stěna obsahuje chitin, manan, glukany, proteiny (tedy nejsou Gram-pozitivní) • •mají schopnost zkvašovat mono-, di-, nebo trisacharidy na ethanol a CO2; většinou fakultativně anaerobní • •nízká teplotní odolnost (usmrcení při 2-5 minutovém zahřívání na 56°C) • •tvorba spor (4, 8 či 16) candida_yeast 3512Fig7 1354783394_Beer Kvasinky •široké využití • (potravinářství, farmacie, medicína, modelové organizmy, atd.) • •ale i patogenní kvasinky • •genom - 1. osekvenovaný eukaryotický organizmus –S. cerevisiae 12 Mb, 16 chromozomů (1996) –S. pastorianus 25 Mb, 36 chromozomů (2009, průmyslový kmen) wine yeast-infections1 sourdough-slice2 Koláž piv Využívané kvasinky Odhad: 670 000 druhů kvasinek cca 30 druhů kontaminace výroby nápojů 800 známých druhů cca 20 druhů je průmyslově využíváno Pivovarské kvasinky •kulturní kvasinky používané k produkci spodně či svrchně kvašených piv • •technologicky odlišné druhy S. pastorianus (spodní kvasinky) • a S. cerevisiae (svrchní kvasinky) • •hybridní, polyploidní (tri- či tetraploidní), často i aneuploidní mikroorganizmy • •vyšší počet kopií některých genů → větší genetická a biochemická flexibilita (schopnost přizpůsobit se stresujícím technologickým podmínkám) • •tolerance ke chmelovým látkám, nízké teplotě, průmyslovým stresům Buňka kvasinek •http://uregina.ca/~babu200m/ yeast_cell composition-english Buněčná stěna •odlišné složení od prokaryot (bakterií)!!!! • •tvorba jizev - pučení (chitin) • •shlukování (i s bakteriemi), rozpoznávání buněk opačného párovacího typu, přilnavost k povrchům, … • •polysacharidy (β-1,3-glukan, β-1,6-glukan) • glykozylované bílkoviny (manoproteiny) chitin • •po odstranění vznikají protoplasty 1-s2 kvasinky-bunky-1 JGB-1-102-g001 Buněčná stěna nrmicro1815-f1 teplakovina-vyplnek-metraz-bavlna-polyester-380g-bila albicans_cell_wall Flokulace kvasinek • ovlivněna celou řadou faktorů kmen kvasinek, médium, typ kultivace, čas, pH... • komponenty flokulace: buněčné stěny kvasinek (α-mannany, proteiny - Flop = zymolektiny a Ca2+ ionty) • mechanizmus flokulace: „ povrchový protein (zymolektin) ční z buňky a v přítomnosti Ca2+ váže cukernaté zbytky na povrchu sousední buňky“ • měření schopnosti kvasinek shlukovat se promývání buněk či přidání vápenatých iontů přidání cukru? • koflokulace • • • • • • Flokulační test modifikovaný Helmův sedimentační test porovnání rychlosti sedimentace buněk v přítomnosti a nepřítomnosti Ca2+ iontů I část narostlých buněk je promyta EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová, Chelaton 2 – vyváže ionty II část kultury je naopak promyta roztokem obsahujícím Ca2+ Rozdíl v rychlosti sedimentace se stanoví nefelometricky – stanovení procenta flokulace Saccharomyces cerevisiae RIBM 139 Saccharomyces pastorianus RIBM 95 Kultivace: 25°C a)Třepaná b) Statická Materiál a zařízení •Chemikálie a roztoky: YPD médium (2% pepton, 2% D-glukóza, 1% kvasničný extrakt; pH 6,34) EDTA 50 mM, pH 7,0 promývací roztok – CaSO4 0,51 g/l sedimentační roztok - CaSO4 0,51 g/l; octan sodný 6,8 g/l; kyselina octová 4,05 g/l; etanol 4% (v/v); pH 4,5 •Přístroje: centrifuga, pH metr, vortex spektrofotometr Spekol 20 http://t0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQPyS_pi1vU938Ymjmbxy60c6sjppCtzAain-dfBws1Bb81bRWz Postup •Buňky (20 ml) centrifugujeme 5000 rpm; 10 min •Supernatant odlijeme do skleněné kádinky •Sediment buněk resuspendujeme v destilované vodě •Sediment naředíme na koncentraci buněk 108/ml (A= cca 1,700±0,050 ); Spekol 20/620 nm) •Ze suspenze odebereme 400 μl ve 3 opakováních do zkumavek označených A a B • Suspenze ve zkumavce A •promyjeme 1 ml destilované vody a centrifugujeme (5000 rpm/5 min) •sediment resuspendujeme v 1 ml 50 mM EDTA a důkladně promícháme •poté přeneseme 1 ml suspenze do 9 ml destilované vody, promícháme •přeneseme 1 ml suspenze do 2 ml destilované vody a ihned změříme A při 600 nm (A) Suspenze ve zkumavce B •promyjeme 1 ml promývacího roztoku a centrifugujeme (5000 rpm, 5 min) •sediment resuspendujeme v 1 ml sedimentačního roztoku, řádně promícháme •1 ml suspenze přeneseme do zkumavky; takto se vzorek ponechá 20 min stát v klidu •po této době odebereme svrchních 100 μl a přeneseme do 900 μl destilované vody •ke vzorku přidáme 2 ml destilované vody a ihned změříme absorbanci při 600 nm (B) •Míru flokulace vypočteme podle vzorce: • • • • kde A =absorbance vzorku ze zkumavky A • B = absorbance vzorku ze zkumavky B. • •Vyhodnocení a závěr •Z naměřených hodnot vypočteme % flokulace pro jednotlivé kmeny v daném typu kultivace a vytvoříme tabulku (hodnoty od všech skupin ve cvičení). Sestrojíme graf, kde je osa x – kmen kvasinek; osa y - % flokulace; vedlejší osa y – pH a statisticky porovnáme získané výsledky (závislost flokulace na podmínkách kultivace a rozdíl mezi studovanými kmeny. • •