Podstata přenosu signálů • Představuje zákonitě koordinovanou souslednost reakcí (odvíjející se od specifické chemické struktury, podstatou je změna konformace) vedoucích od vnější plasmatické membrány (návázání regulátoru na tuto membránu anebo průchod regulátoru touto membránou) přes cytosol k jádru (expresi genetické informace). • Tohoto procesu se účastní řada regulátorů různé chemické povahy. • Výsledkem je zapezpečení všech fyziologických funkcí buněk a organismu včetně regulace cytokinetiky. • Jeden z principiálních rozdílů spočívá zejména v tom, zda má daný regulátor povahu hydrofilní (lipofóbní) anebo Hydrofóbní (lipofilní) Transdukce (přenos) signálů 2 receptory růstové signály hydrofilní povahy (proteiny, katecholaminy, apod.) molekuly signálové transdukce molekuly zesilovací kaskády regulátory transkripce cykliny CDKs p27 p21 p16 p15 Lipofilní regulátory 3 Transdukce (přenos) signálů PŘÍKLADY - ENZYMY 4 Podstatou je změna konformace Nekovalentní pevné interakce mezi dvěma makromolekulami s komplementárními povrchy • Nejjednodušší způsob reakce • Může však spolupůsobit celá škála chemických vazeb silné i slabé povahy a jejich kombinace 5 Substrát přesně zapadne do lůžka v molekule enzymu. V tomto lůžku ho poutají různé typy sil: hydrofobní (modrá), přitahování opačně nabitých skupin (zelená v substrátu a červená v lůžku), vodíkové můstky. Štěpená vazba se tím dostane mezi „nůžky“ silně polárních skupin (např. karboxylů). Při „vyvolaném přizpůsobení“ je enzym teprve domodelován silami, které poutají substrát k jeho lůžku. Jak vzniká komplex substrát – enzym 6 Alosterická aktivace enzymu. Enzym sám není schopen rozštěpit substrát, neboť jeho molekula nemá správný tvar. Teprve naváže-li se na jiné místo regulační molekula (hnědá zprava), než se váže substrát, získá funkční formu. regulační molekula substrát enzym 7 Regulační molekula se připojuje opět na jiném místě molekuly enzymu, než kam se váže substrát. Tím se liší od pouhého blokování lůžka, které může způsobit látka podobná substrátu (soutěživá čili kompetitivní inhibice). Alosterická inaktivace patří k regulačním pochodům. Může ji vyvolat jen zcela určitá látka, ta, která svými vlastnostmi přesně odpovídá místu, na které se váže. enzym Regulační molekula Alosterická inaktivace enzymu. 8 Četné molekuly se štěpí, vstoupí-li do jejich struktury molekula vody při hydrolýze. Jako příklad uvádíme hydrolýzu bílkoviny, kdy mezi atom dusíku (zelený) a uhlíku s vázaným kyslíkem vstoupí molekula vody. Vzniká tak aminoskupina a karboxyl. Chemicky takovou reakci zaznamenáváme: -NH-CO- + H2O = -NH2 + -COOH Samovolná reakce by probíhala velmi pomalu. Katalyzátor ji urychluje působením na elektronové oblaky (oranžová). Elektrony se vzájemně odpuzují, zatímco kladně nabité atomy (protony) je přitahují. Šipky naznačují, jak katalyzátor svými dvěma funkčními skupinami vyvolá pohyb elektronů, čímž se oslabí vazby mezi atomem dusíku a uhlíku, takže se přeruší. Vlastní tělo katalyzátoru udržuje funkční skupiny v přesné poloze, nezbytné k vyvolání naznačených změn v elektronových oblacích štěpené vazby. „Umí“ však i leccos jiného, zejména „připoutat“ látku, která má být štěpena. Katalyzátor umožní, aby reakce proběhla „efektivněji“, po jejím proběhnutí a nezměněn může opakovaně vstupovat do reakce. 9 Katalyzátor Katalyzátor H2O Stavy A a C se od sebe liší obsahem energie, který se může uvolnit jako volná energie Ev. Přesto přeměna A–C neproběhne samovolně. Musí projít stavem B, který má vyšší obsah energie než A. Aby se mohla uvolnit volná energie Ev, musíme stavu A „půjčit“ energii Ea; jen tak se dostane na mezistupeň B. Chemické reakce, syntézy a štěpení, nahodilost a zákonitost dějů 10 Některé energie důležité pro buňky 11 KYSELINA FOSFOREČNÁ JE TROJSYTNÁ KYSELINA (H3PO4), TZN. ŽE V JEJÍ STRUKTUŘE JSOU TŘI HYDROXYLOVÉ SKUPINY SCHOPNÉ ODŠTĚPIT PROTON. JEDEN ATOM KYSLÍKU JE VÁZANÝ PŘÍMO. TVAREM JE PRAVIDELNÝ ČTYŘSTĚN NEBOLI TETRAEDR. TYP HYBRIDIZACE ATOMOVÝCH ORBITALŮ JE SP3; 12 A. Kyselina fosforečná/ortofosforečná B. Kyselina pyrofosforečná C. Kyselina trifosforečná Tyto kyseliny jsou nejdůležitějšími sloučeninami v přeměnách a úschově energie v živých systémech. 13 Vznik a činnost cAMP. V membráně buňky existuje specifická bílkovina, která má dvě funkce: na vnější straně membrány je specifickým receptorem (přijímačem) signální molekuly (hnědá kulička) a na vnitřní straně membrány se po přijetí signálu mění v enzym, který převádí ATP na cAMP a pyrofosfát. Legenda: hnědá kulička – signální molekula žlutá – adenylátcykláza (enzym umožní reakci, po jejím proběhnutí zůstává nezměněn a je znovu Připraven vstoupit do reakce) modrá – alosterická bílkovina (molekula neaktivní) tyrkysová – (aktivní enzym) Oranžová – inhibitor cAMP 1, 2 – dva způsoby aktivace pomocí cAMP 14 („kofaktor“) adenylátcykláza Jeden z hlavních významů popsaných reakcí – značný stupeň zesílení Stupně zesílení: • Každá adenylátcykláza vyrobí mnoho molekul cAMP • Každá molekula cAMP aktivuje jednu proteinkinázu, ta má za úkol především připojit kyselinu fosforečnou na enzym syntetizující glykogen z glukózy, a tím jej vyřadit z provozu. Tak zablokuje mnoho molekul enzymu • Současně naváže kyselinu fosforečnou na kinázu enzymu rozkládajícího glykogen. Tím uvede v činnost mnoho molekul kinázy. (Jedna molekula kinázy aktivuje mnoho molekul enzymu rozkládajícího glykogen). Kdyby každé zesílení bylo jen desetinásobné, pak výsledkem je 10 000 násobné zesílení rozkladu, podpořené zablokováním syntézy. 15 16 změna konformace (rychlost reakcí) P. Cohen: TIBS, 17 (10), 408–413, 1992 Pět základních signálních systémů, které fungují v eukaryotických buňkách 17 18 Pět mezibuněčných paralelních signálních drah aktivovaných receptory svázanými s G-proteiny, tyrozin kinázovými receptory nebo oběma typy HLAVNÍ ROZDÍL V PŮSOBENÍ MEZI REGULÁTORY HYDROFILNÍ (LIPOFÓBNÍ) A HYDROFÓBNÍ (LIPOFILNÍ) POVAHY 19 Struktura membrány může však obsahovat některé funkční prvky, třeba kanálek (dole) s hydrofilním vnitřkem. Kanálek může měnit svůj rozměr, a tím regulovat průchodnost látek. Většinou však v roli regulátorů vystupují membránové bílkoviny. Jak procházejí látky membránami? Polární látky (například ionty) jsou ve vodě obvykle obklopeny několika molekulami vody (hydratovány). To znemožňuje jejich průchod hydrofobní mezivrstvou v membráně. Když se však obalí hydrofobním (lipofilním) pláštěm, snadno přes membránu projdou. 20 receptory růstové signály hydrofilní povahy (proteiny, katecholaminy, apod. molekuly signálové transdukce molekuly zesilovací kaskády regulátory transkripce cykliny CDKs p27 p21 p16 p15 Lipofilní regulátory 21 22 Tři třídy buněčných povrchových receptorů Superodina jaderných receptorů 23 PŘÍKLADY Změna konformace na úrovni membrán a cytosolu 24 Lipidomics reveals membrane lipid remodelling and release of potential lipid mediators during early stress responses in a murine melanoma cell line Gábor Balogh a, Mária Péter a, Gerhard Liebisch b, Ibolya Horváth a, Zsolt Török a, Enikő Nagy a, Andriy Maslyanko a, Sándor Benkő c, Gerd Schmitz b, John L. Harwood d,⁎, László Vígh a,⁎Biochimica et Biophysica Acta xxx (2010) xxx–xxx Přehled možných drah uvolnění kyseliny arachidonové (AA), použitývh inhibitorů a detekovaných lipidových meziproduktů (podtrženo) 26 Tvorba vazebných míst inositol fospholipidu PI 3-kinázou 27 Jedna z cest podpory buněčného přežití přes PI 3-kinázu 28 3-D struktura proteinové kinázy PLA2: fosfolipáza A2, 5-LOX: 5-lipoxygenáza, 5HETE: 5 hydroxykyselina, LTA4, C4: leukotrien A4, C4, PKC: protein kináza C, DAG: diacylglycerol, PIP2: fosfoinositoldifosfát, PLC: fosfolipáza C, Tyr K: tyrosin kináza Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ AA 5HETE LTC4LTA4 PIP2DAG Tyr-K Tyr-K PLA2 5-LOX PKC PLC + Nuclear responses EGF EGF 29 Přenos signálu přes receptor pro epidermální růstový faktor (EGF) se zapojením drah metabolismu kyseliny arachidonové (AA) Transport vápníkových iontů pumpou Ca2+ 30 Kaskáda proteinových kináz v přenosu signálu Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ ATPase PIP2 DAG Ca 2+ PLC RSRS G C K sm ACTIVATION OF CELLULAR TARGET PROCESSES protein phosphorylation kinase kinase kinase kinasekinasekinasekinase 31 A. Basu: Pharmacol. Ther., 59 (3), 257-280, 1993 32 Struktura izoforem protein kinázy C (PKC) A. Basu: Pharmacol. Ther., 59 (3), 257-280, 1993 33 Model aktivace protein kinázy C Figure 3–65. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. 34 Evoluční strom vybraných proteinových kináz 35 Fosforylace proteinů !! GTP-vazebné proteiny jako molekulární spouštěče 36 37 Cdk protein funguje jako nástroj integrace 38 Protein kináza typu Src funguje jako nástroj integrace Proteinové kinázy a fosfatázy 39 INHIBICE B. DĚLENÍ Změna konformace jako podstata řízení cytokinetiky 40 Science 262, 1644, 1993 STIMULACE B. DĚLENÍ Změna konformace jako podstata řízení cytokinetiky 42 R. A. Laskey et al.: Science 246, 609, 1989 43 Schema eukaryotické replikační vidličky ukazující sehrané působení DNA polymeráz a a d na opačných stranách vidličky J. O. Funk and D. A. Galloway: TIBS, 23, 337–341, 1998 44 Model blokace inhibice komplexů cyklin dependentní kináza – cyklin prostřednictvím p21 PODSTATA – ZMĚNA KONFORMACE 45 Receptorem zprostředkovaná dráha aktivace 46 PŘÍKLADY Změna konformace na úrovni genomu 47 48 Alosterický “walking” protein 49 Aktivace NF-kB TNF-a 50 Tvorba signálních proteinů s PH doménami k plasma tické membráně během aktivace B buněk Některé signální proteiny fungující přes cytokinové receptory a signální dráhu Jak-STAT 51 52 Jak-STAT signální dráha aktivovaná a-interferonem Model Smad-dependentní signální dráhy aktivované TGF-b 53 Kontrola transkripce genů environmentálními signály 54 55 Aktivace protein kinázy typu Src dvěma následujícími ději Srovnání dvou hlavních vnitrobuněčných signálních mechanismů u eukaryotických buněk 56 Velké konformačmí změny v EF-Tu způsobené hydrolýzou GTP 57 informace materiální zázemí, finanční zdroje, atd. potenciál informace materiální zázemí, finanční zdroje, atd. informace materiální zázemí, finanční zdroje, atd. informace materiální zázemí, finanční zdroje, atd. informace materiální zázemí, finanční zdroje, atd. Plýtvání Lenost Nižší efektivita Nižší efektivita Vysoká efektivita (Lenost) Lepší var. 58 VŠECHNY HLAVNÍ KOMPONENTY SPOLUPŮSOBÍ 59 60 61 62 63 Negenotoxické hepatokarcinomy (nádorové promotory, hormony, TCDD) Negativní mutagenicita (Nereagují s DNA) Nízká dávka Vysoká dávka Inhibice oxidativního stresu Indukce reparace DNA Inhibice proliferace v oblastech GST-P+ ohnisek Suprese apoptózy Protekce GJIC Aktivace detoxifikačních systémů v játrech (CYP2C11, P-450 NADPH oxidoreduktáza) Buněčná signalizace (GABA, MAP kinázy) GST-P: glutathion S-transferáza placentární forma Indukce oxidativního stresu (P-450, ROS, 8-OHdG) Indukce reparace DNA Zvýšení proliferace v oblastech GST-P+ ohnisek Indukce apoptózy Inhibice GJIC Inhibice CYP2C11 Hormetický efekt na karcinogenezi (Inhibice GST-P+ ohnisek a rozvoje nádoru) Promoce karcinogeneze (Indukce GST-P+ ohnisek a rozvoje nádoru) Přesné prahování karcinogenicity Fukushima et al., Carcinogenesis, 2005 64