Deregulace cytokinetiky (možnosti ovlivnění)
(homeostáza, zdraví a regenerace organismu)
A. Kozubík
Biofyzikálni ústav AVČR, v.v.i., (Oddělení cytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU (Oddělení fyziologie a imunologie živočichů)
Brno
Deregulace cytokinetiky:
Další příklady jejího ovlivnění
Adamantylaminové Pt(ll) a Pt(IV)
komplexy
Dvojmocné Pt(ll)
s; DMA.
reaKtivni
LA-
Cisplatina (II)
	)COCH, 'kc|
	>COCHa -
Výhoda: Mpofiiní
čtyřmocné Pt(IV)
s DNA nereaktivní)
LA-12
JM
Ml
(1. z řady v klinickém zkoušení)
Biologické „cíle" cisplatiny (adukty s DNA)
Novel Concepts in the Development of Platinum Antitumor Drugs
Curr. Med, Client, - Anti-Cancer Agents, 2002, Vol. 2, No, 4 3
Typy DNA aduktů
H3NX    N Hi
Intra-    1,2 GpG in Ira strand
(80-90%)
-G——VC-
H3Nx ^NH, -G—X—G-
1.2 ApG intrastrand        1.3 GpXpG intrastrand  3 fr6kV6ľlC6
ui i i-**)      jejich výskytu
NH3 H-iN—R t—L
L = ď, H20, SR
-G-
■c-
-X-
-Y-
Intor- 1.2 GpG inters tra n d M,lcl (<1%)
m uiofĽ notional G-addutt
mono-
Fig. (2). Types of cisplatin-DNA adducts and their frequency of formation.
LA-12 (IV)
I reaktivita t lipofilicita (capacity factor HPLC)
IflRflflRflflflflRflfl
							UUUUUUId
(FAAS)				Zvýšený influx LA-12 [19.5* u A2780; 29.3* u A2780cis) Snížená reaktita s cílovými biomol.			
'r'\ speciální typy velkých I
nereparabilních excisiní reparací
NUCLEUS
cisplatin
y
Replication inhibition Transcription inhibition Cell-cycle arrest_
DNA repair Cell death
Úloha vybraných proteinů:
- Cyklin A, B1, cdk2 (+ regulace b. cyklu);
- p21, Gadd45a („p53 target genes" - regulace b. cyklu);
- Bax (apoptóza);
- Gadd 45a („DNA repair");
- Mdm2 (regulace stability p53)
Cdkl-cyclin B
Cytotoxic action and molecular basis of cisplatin
ZH Siddik
Molekulární podstata cytotoxického působení cisplatiny iniciované adukty DNA
B. smrt závisí na relativní intenzitě Signálů
LA-12?
Figuře
pnlhwnys
med in li np
cisplm in-induced cellnlnr effects. Cell death or cell survival will depend on the relative intensity of the signals generated and the crosstalk between the pathways involved. Some of the signaling discussed in the text has been omitted for clarity
U buněk rezistentních k cisplatině je f-ce p53 (dráhy vedoucí k apoptóze)
narušena.
Přispívají k tomu
změny v regulaci proteinů r. Bel, Fas,
Survivinu, Glutathionu
Figuře 6 Disruption of p53-dependeni apoplolic palhway in ci splat in -re si sta ni lumor oells
Oncogene
„Dose-response" kfivky (Mutest)
Nejcitlivejsi k cis-DDP ziskan4 rezistence
A2780
A2780cis
Cisplatin:  ICSQ = 1.34
IC90 = 6.17nM
LA-12:    ICso = 0.22nM ICS0 = 1.DD liM
120 ~i
Cisplatin: IC60 = 24.23 nM ICgo = 48.07 \M
LA-12:    IC50= 1.40|lM = 2.65 jlM
0.01       0.1 1 10       100      1000 0.01       0.1 1 10 100
Concentration Faktor rezistence (18:6) = 3     Concentration [\M]
1000
Fig. 2. Time- and close-response effects on the survival of A2780 and A2780cis cancer cell lines. The effects after 72 h exposure to cisplatin or LA-12 in a concentration range between 0.3 |jlM and 256 (xM were determined by MTT assay. The calculated drug concentrations inhibiting metabolic activity of cells by 50% (IC50) and 90% (IC90) are displayed for both derivatives. The results are expressed as mean 1 standard deviations (S.D.) of at least three independent experiments; all concentrations were tested in three replicates.
Rozdílný vliv cisplatiny a LA-12 na buněčný cyklus
A2780 (single staining)
Kozubik etal., 2005, Biochem Pharmacol
Rozdílný vliv cis-DDP a LA-12 na buněčný cyklus
A2780ciž\
G0/G1: 51.1 ± 4.4 % G0/G1: 18.4 ± 10.0 % (*) G0/G1: 24.3 ± 6.3 % (*)
4B hr
72 hr
G0/G1: 66.3 £5.1 % S: 23 34 ± 3.2 % G2/M: 10.4 + 2.7%
G0/G1:43.9 ±5.0% (*) S: 34.1 ± 5.0 % G2/M:21.9±2.5%(x)
G0/G1: 39.9 ±3.1 % (*) S: 37.0 ± 11.3% (*) G2/M: 27.5 ± 7.7 % (x)
Kozubik etal., 2005, Biochem Pharmacol
- Cyklin A, B1, cdk2 (+ regulace b. cyklu);
- p21, Gadd45a („p53 target genes" - regulace b. cyklu);
- Bax (apoptóza);
- Gadd 45a („DNA repair"); ^SllIPP^^H
- Mdm2 (regulace stability p53) ^HNP^63^^I
Hladiny proteinů regulujících buněčný cyklus (cyklinA, B1, cdk2) u buněk A2780 a A2780cis po působení LA-12 a cisplatiny
6 h
12 h
24
A2780cis
A2780
cyclin A
Fold increa&e TO    079 U3
cdk2
A27S0
to  o   n       í.o í.i í.o
Fold uicrease 1.0     1.0 1.0
cyclin B1
1.0     1.1    1.1 1.0 1.0 0.8
Fold íiicrease        1.0     0.9 0.8
1.0     0.9     0.9 1.0 1.1 1.1
A2780cis A2780
1.0 1.1 1.2 1.0 1.2 1.1
A2780cis
10 13 11
1.0 1.2 1.1 1.0 1.0 1.0
1.0 1.1 1.2 1.0 1.3 1.3
1.0 1.2 0.8
1.0 1.4 1.2
p-actin
Nebyly pozorovány žádné změny
Exprese PARP a p53 (Western b.) u A2780 a A2780cis
I A2780
A2780CIS
(a) PARP 24 h
48 h
72 h
p53
24 h
48 h
72 h
113kDa 89kDa
113kDa 89 kDa
113 kDa 89kDa
53 kDa
53 kDa
53 kDa
											
											
	S		o S *J	r a í	r 3 ?■		S 5 S	ŕi U"'i		i-I í	r S í
24 h	1	í.i* o. s*	4 6* 1.4*	1.6* 0,1	2.3* 0.8'	24h	1	6.2± 1.1*	8,2* 1.0*	0.2*	2S± 0.9'
4Sh	1	4.1i 1.4	5.8* 1.8*	2.6* 11 2	4. S* 19*	4Sh	1	6. S* 1.»"	6.9* 0.2*	5.2*	.1.4i 0.6'
72 h	l	2.5*	3.7* 0.7*	1.6* 0.1	2.3* 0 6*	72h	1	5.6± 2»«	7.0* 28«	3.3± l>8	3.3* 1 0
											
(d) p -actin
42 kDa
Fig. X. Western blot analyses of (a) PARP (upper panel) and (b) p53 (middle panel) protein levels in A27X0 (left panel) and A27X()cis ceils (right panel). The cells were not exposed (untreated controls) or exposed to [C50OI ICtjo concentrations of cisplalin or LA-12 and harvested at 24 h.48 It, and 72 b of sustained drug treatment. Otic representative experiment of at least three is presented. Table (c) contains values of p53 expression quantified by densitometry (mean ± S.D. of at least three independent experiments). The symbols (*) denote significant difference (/> < 0.05) from untreated control" (#) denote significant difference (p <0.05) between eqtiitoxic cisplatin and LA-12 effects. Equal loading is documented by detection of (d) p-actin (bottom panel).
cis-DDP indukují vyšší expresi proteinu p53
poškození DNA, než po apl.        a tudíž by cis-DDP měla působit efektivněji),
M
ebylo tomu tak, tzn. že
např. s poškozením DNA nesouvisející mechanism působení LA-12 !!!!!!
1 RP-Bubsirái k&sp&zy
Detekce pi se zasta
6h
A2780 A2780cis
12h
A27S0 A2780cis
24 h
A2780 A2780ciS
i nn \nn
/   /   F /   / J*
p53|-----
1.0 2.2 2.1 1.0 1.6 0.9
Gadd45a
DNA repair");
Fold increase
Mdm2
FolnmL.ea:e  1.0    3.1   2.9    1.0    2.0    0.8 1.0 2.1 1.9 1.0 1.6 1.2 1.0 1.5 1.2 l.d 3.2 3.0
1.0 3.5 2.9 1.0 4.6 0.3
1.0   0.9    1.0   1.0   0.9   1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 1.0 0.S 0.5
*I*J
FoldiMease   1.0     1.1     1.0     1.0    1.0    1.2 1.0 1.0 1.1 1.0 1.2 0.8 1.0 1.0 0.9 1.0 0.9 0.8
[3-actin
Tyto výsledky,
posouvají do nových oblastí.
cisplatiny a LA-12, výzkum platinových cytostatik
Studie z poslední doby cisplatina inhibuje růst nádorových
buněk v koncentracích, které jsou významně nižší, než konc. potřebné pro inhibici syntézy DNA. ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ To naznačuje, že jiné mechanismy působení
primárně založeny na poškození DNA
ty, které jso
mohou reagovat s dalšími buněčnými strukturami (komponenty) jako jsou:
> RNA,
> proteiny,
> cytoskeletálni filamenta
> thioly- obsahujíc! molek J y
> InTJiinTETiBrolBffi
Odvozené mechanismy mohou být významnou součástí signálních kaskád regulujících dělení a smrt buněk
Předpoklad
Vzhledem ke své lipopfilicitě, lze očekávat, že alespoň některé příznivé efekty působení LA-12 by mohly být (alespoň částečně),
spojeny s interakcemi této látky se složkami b. membrán
(anebo by mohly být modulovány ovlivněním membránového složení). ^
SIGNAL (např. cytokiny)
MOLEKULÁRNI MECHANISMY působení co-3 a co-6 VNMK
(mediatory a modulátory buněčné signalizační sítě)
buněčného růstu diferenciace a apoptózy
lipidové rafty
Výsledky reflektující úvahy o potenciálním zapojení fosfolipidových struktur v mechanismech účinků pt-cytostatik
Lze vyslovit předpoklad, že u obou námi studovaných ot - cvtostat
lišících se lipofílicitou dochází k významným rozdílům jíž i dostupnosti do buňky.
Dale, je známo, ze
k rezistenci buněk k cis-DDP může přispívat složení a distribuce fosfolipidových komponent v membránách. Významné rozdílnosti v „seskupování" lipidů (tzv. „lipid packing", FCM, merocyanin) jsme prokázali i v našich předběžných pokusech
A2780aA2870cis.
Naše další výsledky s využitím kalorimetrie provedené na umělých lipozomálních strukti
DPPC naznačí
IEP!
že zatímco ani cisDDP ani LA-12 samy o sobě nemění vlastnosti lipozómů, přidání AA významně mění charakter termogramu ve smyslu zvýšení membránové fluidity.
Kombinace AA s cis-DDP anebo s LA-12 naznačily tendence k fázové separaci
(změny nebo objevení se druhého píku),
kdy se tyto píky liší po kombinaci AA s cis-DDP od kombinace AA s LA-12.
Vznik
suspenze vhodných polárních lipidů (např. lecithin) + působením ultrazvuku
Dynamický charakter biologických membrán (model)
t 1 i [—i 1 i 1 i 1 r-' i 1 i 1 r-' i 1 i 1 r-' r
DPPC + CP
Í
DPPC
1 |lM
.........................
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 DPPC + LA12	
* 1 !l	i
DPPC____ J	
	
lOfiM I	
50 HM ____^ ................	v— C .......
,C"
26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 TEMPERATURE (°C)
Vliv CP na DPPC multilamelárni lipozómy
30 35 40 45
TEMPERATURE ("C)
Vliv LA 12 na DPPC
Rozdíly AA + cisplatina (CP) vs LA-12
111111111111111111111111
(DPPC + 100 |iM AA) + CP
i i i i I i i i i I i i i i I i i i i I i i i i
1.5 mJ/K	i i i i 1 i i i i 1 i i i i 1 i i i i (DPPC + 100 uM AA) + LA12	
		
lOuM y		
____y^~^		
.................		
30        35 40 TEMPERATURE (°C)
30        35        40 45 TEMPERATURE (°C)
í        30        35        40        45 50 TEMPERATURE (°C)
VlivAA
Po 50|iM AA pozorujeme snížení píku odpovídajcího předpřechodu a zároveň rozšiřování hlavního fázového přechodu - zvýšení fluidity??? přičemž se entalpie přechodu nemění.
35 40 45 TEMPERATURE (°C)
Vliv DHA
je zřejmé, že tendence změny je podobná jako po AA.
DHA
(DPPC + 100 nM DHA) + LA 12
30 35 40 45
TEMPERATURE ("C)
fpľOVBúBnB na umelýcn lioozornélnicn
Zatímco
emění vlastnosti lipozómů
amu
m cisDDP ani LA-12 samy o sobe n
přidán] AA výzrmrnnš mění ch&r&klBľ íBrrnogn ve smyslu zvýšení membránové fluidity
KombjmcB AA s cis-DDP anebo s LA-12 naznačily tendence k fázové separaci
(změny nebo objeveni se druhého piku).
Tyto piky se po kombinaci AA s cis-DDP vs. AA s LA-12 lišily.
Je dále známo
k rezistencí buněk k cis-DDP muž;
JOZE
fosfolipidových komponent v membránách.
Význa tzv.Jic
d u (2
ní a distribuce
amné rozd id packi
ÍJnosti v „seskupování11 lipidů
gw, FCM, merocyanin - váže se na wrozvolněnou* strukturu
íscence) - cca odráží' míru fluidity
jsme prokázali
v precJDeznycn pokusecn
Cytoskeleton
Carbohydrate
Figure 21 The Fluid-Mosaic-Model of the cell membrane. Like a mosaic, the cell membrane is a complex structure made up of many different parts, such as proteins, phospholipids and cholesterol. The relative amounts of these components vary from membrane to membrane, and the types of lipids in membranes can also vary.
Pietzsch J et al. Nature Reviews, October 200
ierfl většiny bioloc
s dalšími biologicky významnými molekulami
měnit intenzitu        směr sign. transdukce
lipidovych mikrodomén glykosfingolipidy cholesterol
LA-12 indukuje „upregulaci" DR5, nikoli DR4 (1) na úrovni mRNA (a) i celkových povrchových proteinů (b), a zvyšuje zastoupení DR5 v
lipidových raftech (2a,b)
Zastoupení DR5 a DR4 v membránách I —  HCT 116   — Celkové hladiny DR5 -1                  ^ (lipidové rafty)
(lipidové rafty)
O)
■i
S 4 —
C
o 3
w w
ř 2
CL K
a> 1
CĽ
a
0
I-1 DR5
cisplatin (^íM) LA-1Z (>iM)
-     -     - M.5
0.1 0.5 1
1
cisplatin LA-12
control
cisplatin
LA-12
(2b)
M     • •
Lokalizace DR5 v lipidových raftech
Lipidové výživy vhodného složení
„přenos signálů" membrána-cytosol-jádro
UCINEK
poškození cytoskeletu, oxidatívni stres...
LIJ
O < m
-tu
N
LIJ
apoptóza
buněčný cyklus a proliferace
P^dsitata nrjožjTjých r já vrhů prcíjsliiů