Téma P01: Diagnostika stafylokoků K nastudování: Rod Staphylococcus. (z internetu, učebnic apod.) Dále: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace. Úkol 1:Mikroskopie infekčního materiálu Popis (napište názvy útvarů a spojte je šipkami s objekty nakreslenými vlevo) V mikroskopu sledujte preparát obarvený podle Grama. Popište a zakreslete sledované útvary. Všímejte si přítomnosti bakterií (jejich tvaru, barvitelnosti a množství) dále také leukocytů, epitelií a vzájemného poměru mezi nimi. Tabulka pro souhrn výsledků úkolů 2 až 7 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N Gramovo barvení – Úkol 2 Úkol 3: Kulti- vace (krevní agar) Velikost Barva Tvar Profil Hemo- lýza Jiné Úkol 4: růst na KA + 10 % NaCl Úkol 5: kataláza (pište „+“ či „–“) DÍLČÍ ZÁVĚR Úkol 6a: Test clump. faktor (+/–) Úkol 6b: Plasma-koaguláz. test (+/–) Úkol 6c: Test hyaluronidázy (+/–) Úkol 7: STAPHYtest 16 KONEČNÝ ZÁVĚR Pokud některý test u některého kmene neprovádíte, proškrtněte ho. Konečný závěr ale napište pro všechny. Úkol 2: Mikroskopie kultur mikroorganismů Kmen K Kmen L Kmen M Kmen N Obarvěte podle Grama čisté kultury předložených mikrobů. Výsledky pozorování zakreslete (↓) a zapište (↑). Úkol 3: Růst na krevním agaru Vyplňte tabulku na první straně v řádcích „Úkol č. 3“. Do „jiných“ napište to zajímavé, co se nevejde jinam. Úkol 4: Růst bakterií na krevním agaru s 10 % NaCl Zhodnoťte schopnost růstu předložených kmenů na krevním agaru s 10 % NaCl, který slouží jako selektivní půda pro stafylokoky. Zapište „+“ pokud kmen roste a „–“ pokud neroste. Úkol 5: Katalázový test Prokažte přítomnost enzymu katalasy. Setřete mikrobiologickou kličkou kolonie předložených kmenů a vneste je do kapky 3% H[2]O[2] na podložním sklíčku. Zaznamenejte reakci u všech kmenů. Do tabulky pište „+“ a „–“. Pozitivitu charakterizují _____________________, zatímco ____________________ je negativní. Nyní vyplňte v tabulce řádek „Dílčí závěr“. Napište STAF, pokud se kmen ukázal býti stafylokokem, a JINÝ, pokud je to něco jiného. Úkol 6: Testy pro diferenciaci S. aureus 6a) Test na clumping faktor (test vázané plasmakoagulázy) Na podložní sklíčko kápněte kapku ředěné králičí plazmy. Pomocí sterilní mikrobiologické kličky v ní suspendujte vyšetřovaný kmen stafylokoka. Přítomnost plasmakoagulázy se projeví aglutinací bakteriálních buněk. Výsledek vyšetření zakreslete a zapište sem i do tabulky. Kmen _____ (písmeno) pozitivní – negativní (škrtněte co neplatí) 6b) Plasmakoagulázový test (test volné plasmakoagulázy) Do 0,5 ml 10× ředěné králičí plazmy bylo suspendováno několik kolonií vyšetřovaného kmene stafylokoka. Suspenzi inkubujeme v termostatu při 37 °C. Výsledek se odečítá po 1, 2 a 24 hodinách. Jako pozitivní reakce se hodnotí, pokud dojde ke koagulaci králičí plasmy ve zkumavce, tj. dojde k zrosolovatění celého obsahu zkumavky, příp. alespoň části. Zapište a zakreslete výsledek této reakce u vybraných kmenů po 24 hodinách inkubace. (Zkumavka je v nákresu záměrně nakloněná, aby bylo vidět, zda je uvnitř hladina tekutiny.) Pozitivní výsledek Negativní výsledek 6c) Detekce hyaluronidázy Na krevní agar jsme naočkovali asi 2 cm široký pás Streptococcus equii, bakterie, která tvoří silné pouzdro s obsahem kyseliny hyaluronové. Kolmo k tomuto pásu byla naočkována čára vyšetřovaného kmene stafylokoka. Pokud je příslušným kmenem stafylokoka hyaluronidasa produkována, difunduje do okolí a do druhého dne způsobí lýzu pouzdra Streptococcus equii. To se projeví půlkruhovou zónou „ztráty slizovitosti“ v pásu naočkovaného Streptococcus equii. Zakreslete výsledek reakce u dvou kmenů (včetně pozitivní a negativní kontroly) a popište. Pozor! V tomto úkolu nejde o hemolýzu kmenů. Do obrázku ji sice – pokud ji pozorujete – můžete zakreslit, není to však pro tento úkol podstatné. Dbejte pokynů učitele a úkol provádějte až po jeho výkladu! Úkol 7: Bližší určení stafylokoků pomocí biochemického mikrotestu (STAPHYtest 16) Pro identifikaci stafylokoků je určena sada biochemických testů. Podle tabulky v návodu k použití nebo podle barevné srovnávací šablony odečtěte výsledky jednotlivých reakcí. Výsledky testů pro jednotlivé kmeny zapište a na základě interpretačních tabulek zjistěte, o které druhy stafylokoků jde. Začátek výsledků pro první kmen máte předvyplněn. Nezapomeňte vyplnit též procento pravděpodobnosti a index typičnosti! Zkum. První řádek vlastního testu s 8 jamkami Druhý řádek vlastního testu s 8 jamkami VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A K + + + – – – + + – 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 7 0 3 Kód: Identifikace Staphylococcus ___________ % pravděpod. T index VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A L + 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 7 Kód: Identifikace Staphylococcus ___________ % pravděpod. T index Úkol 8a: Citlivost stafylokoků k antibiotikům Zjistěte citlivost předložených kmenů stafylokoků k vybraným antibiotikům, pomocí diskového difusního testu. Citlivost k předkládaným antibiotikům zhodnoťte na základě srovnání změřeného průměru inhibiční zóny s příslušnou hraniční zónou. Seznam testovaných antibiotik a hodnoty jejich hraničních zón najdete v přiložené tabulce. Výsledky testu pro jednotlivá antibiotika (průměr inhibiční zóny i interpretaci) zapište. V případě, že zóna citlivosti není vůbec přítomna, proškrtněte průměr zóny a rovnou zapište „R“. Antibiotikum (plný název, ne zkratka) S. aureus S. epidermidis Průměr zóny (mm) Interpretace* Průměr zóny (mm) Interpretace* Cefoxitin (FOX)* (ref. zóna viz níže) Erythromycin (E) (ref. zóna 21 mm) Clindamycin (DA) (ref. zóna 22 mm) Ko-trimoxazol (SXT) (ref. zóna 17 mm) Tetracyklin** (TE) (ref. zóna 22 mm) Chloramfenikol (C) (ref. zóna 18 mm) zapisujte C = citlivý, R = rezistentní, případně D = dubiózní (hraniční zóna, velikost právě rovna referenční) *interpretuje se jako oxacilin a další betalaktamy; ref. zóna je 22 mm pro S. aureus a 25 mm pro S. epidirmidis **výsledek testu citlivosti platí i pro doxycyklin Úkol 8b: Demonstrace screeningové půdy na MRSA U předložených kmenů (na bočním stole) ověřte, zda jde o MRSA. (Je možné, že půjde jen o jeden kmen, v tom případě chybějící řádky vynechejte. Kmen Kmen je MRSA – MRSKN – MS stafylokok* MRSA – MRSKN – MS stafylokok* MRSA – MRSKN – MS stafylokok* *nehodící se škrtněte: MRSA = meticilin rezistentní S. aureus, MRSKN = meticilin rezistentní koagulázanegativní staf., MS = meticilin citlivý