Diagnostika stafylokoků
P01
Stafylokoky
Rod Staphylococcus
Grampozitivní koky, nejčastěji ve shlucích tvaru
hroznů
Nepohyblivé a nesporulující
Velmi odolné (vyschnutí, vyšší koncentrace solí
- 10 % NaCl)
Rozdělení podle koagulace plazmy na
- koaguláza pozitivní (S. aureus)
- koaguláza negativní
Staphylococcus aureus
(zlatý stafylokok)
Jediný pro člověka běžně významný z tzv.
koaguláza pozitivních stafylokoků
Výrazná beta- hemolýza
Virulenční faktory S. aureus
koaguláza – sráží krevní plazmu; znak patogenních
stafylokoků
fibrinolyzin – rozpouští fibrinové sraženiny
leukocidin (PV toxin) – lýza leukocytů
deoxyribonukleáza – znak patogenních stafylokoků
enterotoxiny – jsou produkovány v potravinách; způsobují
zvracení a průjmy
hyaluronidáza – enzym, který produkují stafylokoky a
usnadňuje invazivitu
adherence (přilnutí), pouzdro (proti fagocytóze), tvorba
biofilmu, PBP2a, enzymy degradující ATB beta-laktamázy
aj.
TSST-1 (toxin syndromu toxického šoku)
- způsobuje toxický šok
Některé kmeny produkují enterotoxiny - entrotoxikóza
(intoxikace bakteriálním toxinem se projeví velice
rychle, obvykle také rychle odezní)
Exfoliativní toxiny (epidermolyziny)
- stafylokokový syndrom opařené kůže
Toxiny
Superantigeny
www.zuova.cz/informace/nrlpab16.php
Patogeneze
 Hnisavá onemocnění
 Toxické případy
 Otravy z potravin
 Predispozice: poranění, cizí tělesa, DM,
imunodeficity, virové infekce aj.
Abscesy
Na rozdíl od streptokoků, které
vytvářejí ve tkáních zpravidla
neopouzdřené flegmóny, tvoří
stafylokoky spíše opouzdřené
abscesy (dutina plná hnisu)
Nejčastěji infekce kůže a kožních adnex
(pyodermie)- impetigo, folikulitida, ječné zrno aj.
infekce močových cest
infekce dýchacích cest, pneumonie
(sekundární)
bakteriémie a sepse
katétrové infekce krevního řečiště infekce a
dalších implantátů - biofilm
Onemocnění způsobené S. aureus
hnisavé infekce měkkých
tkání - abscesy
hnisavé infekce ran
hnisavé infekce tvrdých
tkání - osteomyelitis
Koaguláza negativní stafylokoky
Nejběžnější je Staphylococcus epidermidis (30 – 90
% izolátů)
Další, klinicky významní: S. saprophyticus, S. hominis,
S. haemolyticus, S. warneri, S.sciuri,S. capitis, aj.
Jsou součástí normální mikroflóry, zejména kůže
V poslední době jsou velice významnými původci infekcí
u oslabených osob
Způsobují: - infekce močových cest (S. saprophyticus)
- bakteriémie a sepse
- katétrové infekce krevního řečiště infekce a
dalších implantátů - biofilm
Léčba
 U stafylokoků je lékem volby oxacilin
 Makrolidy jen u alergických osob.
 Linkosamidy mají význam u infekcí pohybové
soustavy a opouzdřených procesů.
 Glykopeptidová antibiotika (vankomycin a
teikoplanin) jsou v rezervě. Používají se u
kmenů rezistentních na oxacilin, takzvaných
MRSA.
MRSA a jejich detekce
 meticilin rezistentní stafylokoky (MRSA) jsou
epidemiologicky závažné kmeny, často
způsobující nozokomiální infekce
 příčinou je změna tzv. penicinin binding proteins
(PBP)
 na problém upozorní malá zóna u oxacilinu (ta
však může být způsobena i jinými vlivy)
 za průkazné se považuje, je-li malá zóna nejen u
oxacilinu, ale i u cefoxitinu
Diferenciální diagnostika
 Gramovo barvení odhalí všechny bakterie, které
nepatří mezi grampozitivní koky
 Pozitivní kataláza odliší stafylokoky od
streptokoků a enterokoků
 Stejnou službu (a ve směsi mikrobů ještě lepší)
udělá kultivace na KA s 10 % NaCl
Rozlišení stafylokoků
Plasmakoaguláza volná je pozitivní u zlatého
stafylokoka, negativní u koaguláza negativních,
proto se tak také označují
Clumping factor neboli vázaná plazmakoaguláza
se používá stejně, ale je méně spolehlivá
Hyaluronidáza
Méně spolehlivé testy (nejsou důkazem)
Hemolýza: Koaguláza negativní stafylokoky mohou
produkovat jen delta hemolyzin, zlaté i alfa a beta,
mívají proto mnohem výraznější hemolýzu
Nazlátlé zbarvení kolonií a jejich větší průměr může také
napovědět
Větší shluky v mikroskopii jsou také typické
pro zlaté stafylokoky
V méně závažných klinických případech se
spokojíme s tím, že jde o koaguláza negativního
stafylokoka a netrváme na druhovém určení
Pokud je druhové určení potřeba (např. u
hemokultur), lze je provést biochemicky
V našich podmínkách se používá např. STAPHYtest
16 (Erba-Lachema)
Dourčení koaguláza negativních stafylokoků
Úkol 1: mikroskopie vzorku
Prohlédněte si mikroskopický preparát sputa,
obarvený podle Grama
Pátrejte po grampozitivních kocích ve shlucích a
také po leukocytech (hlavně polymorfonukleárech),
které svědčí pro bakteriální zánět
1 2 3
Úkol 2: barvení kultur podle Grama
Obarvěte podle Grama předložené kmeny (K, L,
M, N)
(pro zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat
plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30 s,
alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda, osušit,
imerzní obj.)
Imerzní olej + imerzní objektiv!!
Úkol 3: popis kolonií na KA
Pečlivě si prohlédněte předložené kmeny
Popište všechny vlastnosti kolonií a zvlášť si všímejte
těch vlastností, které odlišují stafylokoky od ostatních
grampozitivních koků (výrazný pigment, konzistence)
V úkolu 4 identifikujeme
stafylokoka tím, že roste
na KA s 10 % NaCl,
kdežto ostatní nikoli
Úkol 5 katalázový test (kolonie vmícháme do
kapky peroxidu vodíku). Pokud šumí, je to
stafylokok
Pozor! Pozitivní katalázu
má spousta bakterií,
vč. G- tyček a koků
6 a) Clumping factor neboli také vázaná
plasmakoaguláza – rychlé
 Kolonie se vmíchají do kapky králičí
plasmy na podložním sklíčku
 Pozitivita se projeví jako tvorba
„chuchvalců“ v kapce plasmy (viz obrázek
na další obrazovce)
 Nejde vlastně o KOAGULACI, ale o
AGLUTINACI plasmy
 Test není příliš spolehlivý
http://memiserf.medmikro.ruhr-uni-bochum.de
Úkol 6b – volná koaguláza
Kličkou nabrané kolonie vmícháme do králičí plasmy
ve zkumavce
Pokud plasma zkoaguluje (má konzistenci želé), je
koaguláza pozitivní
Souprava Staphaurex a výsledky
http://www.pathologyinpractice.com
www.microbes-edu.org Provedením připomínají
clumping factor, ale jsou
spolehlivější než volná
plasmakoaguláza
 Jsou bohužel poměrně drahé
Úkol 6c: Hyaluronidáza (test dekapsulace)
Princip testu: hyaluronidáza, produkovaná zlatým
stafylokokem (ne však koaguláza negativními
stafylokoky) rozpouští pouzdro bakterií tvořené
kyselinou hyaluronovou (Streptococcus equii)
Ztráta pouzdra se projeví změnou vzhledu
streptokoka (ztráta „hlenovitosti“)
Hyaluronidáza
Co tedy musíte prakticky provést
 V úkolu 6 a) provedete clumping faktorový
test, když kolonie vmícháte do kapky plasmy
 V úkolu 6 b) si prohlédnete výsledek testu
plasmakoagulázy, který byl připraven včera.
Odečítá se orientačně po 4 h a spolehlivě až
po 24 h. Pozitivní je koagulovaná tekutina.
 V úkolu 6 c) si prohlédnete včera připravený
hyaluronidázový test. Pozitivní je kmen, který
„rozpouští slizovitost“ pásu streptokoka
Úkol 7: rozlišení stafylokoků
STAPHYtest 16 – jak ho odečíst
STAPHYtest 16, zahrnuje ve skutečnosti 17 reakcí.
Jako první se odečítá test VPT ve zkumavce.
Červená tekutina ve zkumavce = pozitivní VPT,
bezbarvá tekutina = negativní
První řádek STAPHYtestu = 2. – 9. reakce
Druhý řádek STAPHYtestu = 10. – 17. reakce
Vypočítejte kód a porovnejte s
kódovníkem. Kód je šestimístný.
Prvních pět číslic je z trojic testů,
šestá číslice je z dvojice
Oktalové kódy
 V praxi se každé trojici výsledků přiřadí číslice od
nuly po sedmičku – viz následující obrazovka
 Zaznamenají se pozitivní a negativní výsledky reakcí
 Pod každou trojici se napíše 1 – 2 – 4
 Sečtou se pro každou trojici pouze číslice u „+“,
nikoli u „ –“ (ty se přeškrtnou)
Test JAN LEN MAG TOM PET KAR FRA HAN
Výsl. + – + + + – – –
1 2 4 1 2 4 1 2
Kód 5 3 0
Úkol 8: citlivost k antibiotikům
 Odečtěte difusní diskový test – změřte
zóny a porovnejte s referenčními zónami
 Všiměte si, že S. aureus je relativně
citlivější než koaguláza negativní
stafylokoky.
Odečtení testu citlivosti
Antibiotikum Zkratka Referenč. zóna
Cefoxitin (cefamycin)* FOX 22/25 mm**
Klindamycin (linkosamid) DA 21 mm
Erythromycin (makrolid) E 22 mm
Ko-trimoxazol (směs) SXT 18 mm
Tetracyklin (tetracyklin)*** TE 22 mm
Chloramfenikol
(amfenikol)
C 18 mm
*výsledek platí i pro oxacilin a další betalaktamy **22 mm S. aureus,
25 mm koaguláza negativní stafylokok *** platí i pro doxycyklin
Test citlivosti u zlatého a koagulázanegativního
stafylokoka
Foto veronika Holá
Úkol č 8b - MRSA
 Máte několik kmenů na speciální screeningové
půdě pro MRSA (opakování z jarního semestru)
 Modré kolonie jsou kolonie kmenů MRSA
 Růžové či bílé kolonie jsou methicilin rezistentní
kolonie jiných stafylokoků, než je S. aureus
 Žádné kolonie - jde o methicilin-citlivý kmen