GRAMNEGATIVNÍ
BAKTERIE II.
Rod Haemophilus
 Hemofily jsou krátké
G- tyčinky
 V mikroskopu- od malých
kokobacilů po dlouhé tyčky
 Nerostou na ENDU, dokonce ani na KA,
protože nejsou schopné získat z krvinek
růstové faktory, které potřebují.
Klasifikace hemofilů
 Haemophilus influenzae
 pouzderný typ b (Hib)
 pouzderné typy a, c, d, e, f
 neopouzdřené kmeny
 Haemophilus parainfluenzae (mnohem běžnější a
mnohem méně patogenní), Haemophilus aphrophilus a
mnoho dalších druhů
 Haemophilus ducreyi, původce pohlavně přenášené
choroby ulcus molle
 Velmi běžná je přítomnost hemofilů v krku, přičemž
patogenní role je velmi pochybná. Zvlášť v případě
Haemophilus parainfluenzae nepředpokládáme, že by byl
patogenem.
Haemophilus influenzae
 Dlouho považován za původce chřipky.
 Virulentní kmeny mají polysacharidové pouzdro
(a až f), nejčastěji typ b (Hib).
 Nejzávažnější choroby jsou invazivní infekce u
předškolních dětí - epiglotitida, meningitida,
pneumonie a sepse.
 Další časté choroby jsou otitis media a
sinusitida.
 Od r. 2001 očkování dětí
Růstové faktory hemofilů
 Hemofily vyžadují faktory z krvinek, avšak
jejich potřeba konkrétních faktorů je
specifická:
 H. parainfluenzae vyžaduje faktor V (= NAD)
 H. aphrophilus vyžaduje faktor X (= hemin)
 H. influenzae vyžaduje oba faktory.
H. influenzae (vlevo),
H. parainfluenzae (vpravo)
www.medmicro.info
Pasteurella multocida
 Pasteurella multocida je běžnou flórou v dýchacích
cestách psovitých a kočkovitých šelem.
 U člověka způsobuje zejména zhnisání ran po
pokousání psem či jiným zvířetem.
 Má podobný charakteristický pach, podobný
hemofilovému, ale na rozdíl od něj roste na krevním
agaru (nikoli však na Endově půdě)
 Vypadá tam jako něco mezi streptokokem a
enterokokem, ale je rezistentní na vankomycin, což
obvykle mikrobiologa „trkne“.
Gramnegativní nefermentující
bakterie
 Nejběžnější bakterie ze skupiny gramnegativních
nefermentujících baktérií je Pseudomonas
aeruginosa
 Mezi další patří např. rody Acinetobacter,
Burkholderia nebo Stenotrophomonas
 Striktně aerobní bakterie
 Obecně: Jsou to bakterie z vnějšího prostředí
(saprofyté). Jejich terčem jsou pacienti s
popáleninami, klienti ARK, JIP, transplantačních
center a podobně
Pseudomonas aeruginosa
 G- rovná tyčinka
 Charakteristický zápach (jasmín)
a barva (zelený pigment)
 Vyskytuje se v odpadní vodě, střevě obratlovců,
na rostlinách a v půdě
 Významný původce nozokomiálních nákaz,
kolonizuje vlhká místa pacienta (uši, podpaží,..)
 Infekce popálenin, těžké operativní výkony,
katétry, maligní procesy, cystická fibróza atd.
Nefermentující a cystická fibróza
 Cystická fibróza je těžké, vrozené onemocnění
plic s poruchou produkce normálního plicního
surfaktantu. To vede ke změněným
charakteristikám plic, včetně mnohonásobně
zvýšeného rizika infekce
 Nejčastějšími původci jsou:
Pseudomonas aeruginosa
Burkholderia cepacia
Staphylococcus aureus
Kmeny zpravidla získají polyresistenci.
Burkholderia cepacia
Burkholderia cepacia
způsobuje hnilobu cibule
(Allium cepa), je to tedy
typický rostlinný patogen.
Nozokomiální infekce
dýchacích cest.
Burkholderia pseudomallei
• Burkholderia pseudomallei je původcem
těžkého onemocnění- melliodiózy
• Příbuzná B. mallei způsobuje zoonózu
zvanou malleus čili vozhřivka
Nebezpečné i pro
člověka
Stenotrophomonas maltophilia
Původci respiračních infekcí, ranné
infekce, infekce močových cest
Acinetobacter sp.
http://www.buddycom.com
Z řečtiny: a-kineto- = „nepohyblivý“
Diagnostika hemofilů
a pasteurel
 Pasteurely rostou na krevním agaru
 Hemofily na krevním agaru růst neumí, rostou na
čokoládovém agaru
 Na KA rostou v přítomnosti takové bakterie, která
jim krvinku „otevře“ (satelitový fenomén). Takovou
bakterií je například zlatý stafylokok
 Mají droboučké kolonie, proto se používá disk
k odclonění ostatních bakterií (bacitracin, ale ve
vyšší koncentraci než v bacitracinovém testu)
Hemofily na
čokoládovém agaru
Satelitový fenomén
 Jak už víme, hemofily potřebují faktory
z erytrocytů, ale nejsou samy schopny je
narušit. Narušení může obstarat
 zahřátí agaru (čokoládový agar)
 přítomnost jiného mikroba
 Satelitový fenomén představuje tu druhou
možnost, jak může hemofil získat faktory
z krvinek. Znamená růst hemofila pouze
kolem stafylokokové čáry.
Detekce hemofilů
Hemofily jsou
rezistentnější než
bakterie běžné flóry,
takže rostou uvnitř
zóny, ovšem jen kolem
stafylokokové čáry
(satelitový fenomén!)
Diferenciální diagnostika G-
nefermentujících
 Endova půda: jak již víme, rostou na ní
z klinicky významných jen enterobakterie,
příslušníci čeledi Vibrionaceae a gramnegativní
nefermentující tyčinky
 Nefermentující odliší to, že nefermentují
glukózu (např. Hajnova půda zůstává po
kultivaci celá červená, nezmění vůbec barvu)
K diagnostice nefermentujících
 Pseudomonády se zpravidla poznají:
 Mají typickou vůni (mladé kultury)
 Tvoří pigmenty, nejčastěji zelené, někdy modré či
rezavé. Nejlépe jsou viditelné na MH, ale trochu i na
KA či Endově agaru
 Mají pozitivní oxidázu
 Ostatní nefermentující musíme rozlišit
biochemicky, například NEFERMtestem 24
Úkol 1: Barvení kultur podle
Grama
 Obarvěte podle Grama podezřelé kmeny (pro
zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat
plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30
s, alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda,
osušit, imerzní obj.)
 Rozlišíte bakterie podle tvaru a typu buněčné
stěny. Pro vzájemné G- tyčinek musíte
pokračovat dál.
Úkol 2: Kultivace bakterií
 Podívejte se na výsledky kultivace našich bakterií
na čokoládovém agaru, krevním agaru, Endově a
MH půdě. Popište morfologii kolonií na krevním
agaru. U bakterií, které na krevním agaru nerostou,
popište kolonie na čokoládovém agaru.
 Hemofily potřebují faktory z erytrocytů, ale nejsou
samy schopny je narušit, nerostou na KA
 Pasteurely na KA rostou, na Endu však nikoli
 G– nefermentující naopak rostou na všech
půdách
Úkol 3a: Satelitový fenomén
 Jak už víme, satelitový fenomén znamená
růst hemofila pouze kolem stafylokokové
čáry.
 Přítomnost satelitového fenoménu je
důkazem, že jde opravdu o příslušníka rodu
Haemophilus
 Kolonie jsou mrňavé, prohlížejte je důkladně!
Úkol 3b: Test růstových faktorů
hemofilů
Jeden disk obsahuje faktor X, druhý faktor V, třetí směs obou
Úkol 3c – antigenní analýza –
demonstrace výsledku
 Zapište výsledek aglutinace hemofilů dle obrázku
(jde o kmen K):
koláž s použitím:
www.microbes-edu.org
Úkol 3d: detekce Pasteurella
typickým vzorcem citlivosti
 Žádné gramnegativní bakterie nejsou citlivé na
vankomycin. Vankomycin lze použít jen u
grampozitivních,
 Na druhou stranu, jen málo bakterií je citlivých
na penicilin, zvlášť mezi G– tyčinkami.
 Kombinace citlivosti k penicilinu a rezistence
k vankomycinu je poměrně specifická pro rod
Pasteurella.
Úkol 4: Hajnova půda pro detekci
G– nefermentujících bakterií
 Čtyři z našich kmenů rostly na Endově agaru
(vizte Úkol 2). Mohly by to být G–
nefermentující, Enterobacteriaceae či
Vibrionaceae.
 Typické pro G– nefermentující je
chybění jakékoli změny na Hajnově
půdě (zůstává červená
Úkoly 5a: Oxidázový test
 Proveďte oxidázový test
 Z nejběžnějších G– nefermentujících tyčinek
má Pseudomonas oxidázu pozitivní,
Burkholderia zpravidla také;
Stenotrophomonas většinou ne a
Acinetobacter také nikoli.
Úkol 5b: NefermTest 24
 Pro přesnou biochemickou identifikaci G–
nefermentujících užíváme většinou Nefermtest
24 (nebo podobný jiných výrobců).
 Je to trojstrip (ne dvojstrip jako minulý týden)
 Kód se tu tvoří jiným způsobem:
 první číslice je 0 (oxidáza –) nebo 1 (oxidáza +)
 dalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C
 sloupce B a A se nepočítají (používají se jen pro
případné další rozlišení
Úkol 6 – testy antibiotické
citlivosti
 Hemofily nerostou na MH agaru
 Zpravidla se používá Levinthalův agar
(přefiltrovaný čokoládový agar), na kterém jsou
zóny lépe viditelné než na klasickém
čokoládovém agaru
 G– nefermentující naopak rostou ochotně na
nejrůznějších médiích
6a Tabulka zón citlivosti –
Pasteurellaceae
Antibiotikum Zkratka Referenč.
zóna*
Ampicilin (aminopenicilin) AMP 16 mm
Ko-amoxicilin (am.+inhib.) AMC 16 mm
Cefuroxim (cefalosp. 2G) CXM 25 mm
Tetracyklin (tetracyklin) DO 25 mm
Ko-trimoxazol (směs) SXT 23 mm
Chloramfenikol C 28 mm
6b Tabulka zón citlivosti –
pseudomonáda
Antibiotikum Zkratka Referenč.
zóna*
Piperacilin + tazobaktam TZP 18 mm
Gentamicin (aminoglykos.) CN 15 mm
Ofloxacin OFL 13 mm
Ciprofloxacin (chin 3 gen) CIP 25 mm
Ceftazidim (CS 3 gen) CAZ 16 mm
Colistin CT 11 mm
Zóny u hemofilů jsou často velké
a splývající, což studenty mate!
Jsou-li zóny tak velké,
že se nedají změřit,
tak je neměřte a
prostě rovnou napište,
že kmen je na dané
antibiotikum citlivý.
Zeleně jsou vyznačeny
hypotetické okraje zón
– všimněte si, že
z naprosté většiny buď
splývají, nebo jsou
mimo misku
6c) Kontrola primárních rezistencí
u kmenů burkholderie a
stenotrofomonády
Kmen S. maltophilia by měl být primárně
rezistentní na tato antibiotika….
Kmen B. cepacia by měl být primárně rezistentní
na tato antibiotika….
Úkol 7: Vztahy bakterií ke kyslíku
 Pseudomonáda je striktně aerobní bakterie, nikoli
fakultativně anaerobní jako například Escherichia
coli, natož striktně anaerobní jako Bacteroides
fragilis (bude probíráno v P 07).
Kmen Bujón VL-bujón Výsledek
N roste neroste Striktně aerobní bakterie
T neroste roste Striktní anaerob
M roste roste Fakultativní anaerob