DIAGNOSTIKA ANAEROBNÍCH A ACIDOREZISTENTNÍCH BAKTERIÍ P07 + P08 ANAEROBNÍ BAKTERIE Rod Clostridium  Grampozitivní (relativně velké) tyčinky  Schopny tvořit spóry-vyklenují buňku  Rostou za anaerobních podmínek v prostředí s nízkým redoxním potenciálem, některé tolerují malé množství kyslíku v prostředí (aerotolerantní)  Vyskytují se jako saprofyté ve střevě zvířat a člověka (hnilobné procesy), spóry v prostředí (v půdě, bahně rybníků, v řekách, v prachu i na vegetaci)  Jen málo patogenních druhů. Způsobují neurotoxikózy, enterotoxikózy, a nekrotizující infekce měkkých tkání (vysoká smrtnost) Neurotoxická klostridia Clostridium tetani  Štíhlé tyčinky tvořící endospóry uložené terminálně (paličky na buben)  Součást normální střevní mikroflóry savců, zejména koní, spóry v půdě  Původce tetanu (ztrnutí šíje) Tetanus • Endogenní (vagina či střevo člověka) či exogenní • Sporami infikované hlubší znečištěné či zhmožděné rány, v ráně klíčení spór • Za klinické projevy infekce je zodpovědný tetanický toxin (tetanospasmin), který blokuje inhibici motorických neuronů (brání uvolňování mediátorů této inhibice) • Projevuje se tonickými křečemi příčně pruhovaného svalstva Tetanus www2.bc.cc.ca.us Žvýkací svaly (trismus) Mimické svaly Spasmy svalů trupu Postižení dýchacích svalů Svalové ruptury, zlomeniny Srdeční zástava Tetanus www2.bc.cc.ca.us epistotonus Clostridium botulinum ● Ve střevním ústrojí zvířat, spóry v půdě, prachu, ve vodě, kontaminanta potravin ● Původce botulismu. ● Typy:  Kojenecký botulismus- toxin produkován ve střevě dítěte, C. botulinum se zde pomnoží  Traumatický botulismus  Alimentární botulismus Alimentární botulismus  Do těla nevstupuje původce, ale jen jeho toxin (botulotoxin), zpravidla z nedostatečně upraveného konzervovaného masa- domácí konzervy  Opět účinkuje jako neurotoxin (zabraňuje uvolňování acetylcholinu do synapse a dochází k přerušení vedení vzruchu)  Vyvolává obrny- paralýzy příčně pruhovaných svalů gastrointestinální projevy, rozostřené vidění, ztížené polykání, poruchy artikulace, zástava střevní peristaltiky, zástava močení Clostridium perfringens  Půda, rostliny, střevní trakt zvířat i lidí  Jeden z původců plynaté sněti (spolu s C. novyi, C. septicum aj.)- infekce měkkých tkání (nekróza kůže, podkoží a svalstva), rychle se šířící edém  Plynatá sněť je typické válečné onemocnění. Může se však vyskytnout i při živelných pohromách, úrazy v zemědělství  Exogenní a endogenní infekce (perforace tlustého střeva)  Produkce toxinů- rozpouštění tkání v okolí, destrukce leukocytů, šíření nekrózy  Produkce enterotoxinů – alimentární intoxikace Histotoxická klostridia Clostridium difficile  Významný nozokomiální patogen  Vyskytuje se celkem běžně ve střevě lidí (3-5 %)  Přirozená rezistence k betalaktamovým antibiotikům a linkosamidům, i k běžným dezinfekčním prostředkům. Mytí rukou!!  Některé kmeny produkují toxiny A (enterotoxin) a B (cytotoxin)  Lehčí průjmová onemocnění až pseudomembranózní enterokolitidy, toxické megakolon (často nozokomiální nákazy)  Dnes se k léčbě používá nejčastěji bakteriální chemoterapeutikum metronidazol Společné charakteristiky nesporulujících anaerobů  Vyskytují se jako běžná flóra:  v tlustém střevě tvoří 99,9 % celkového objemu mikrobů, je jich tam kolem jednoho kilogramu  v ústech mohou žít díky biofilmu – jsou do něj zavzaty tak, aby neměly přímý přístup ke vzduchu, který by je ohrožoval  v pochvě nejsou přítomny u všech žen, ale uvádí se, že asi 70 % žen nějaké anaeroby v pochvě má; pokud se zde ovšem přemnoží, jde o dysmikrobii, kterou je nutno léčit  Některé i na kůži  Při zánětu obvykle neexistuje jeden původce, ale uplatňuje se směs. Někdy se používá termín „Veillonova flóra“  Směs striktně anaerobních, ale i fakultativně anaerobních bakterií  Nesporulující striktně anaerobní mikroby mají vzhledem ke svým vlastnostem velmi omezené možnosti přenosu.  Velká část infekcí je tedy endogenního původu Bacteroides fragilis  Pleomorfní tvary (koky, tyčinky či vlákna)  Běžně obývají zažívací trakt, dutinu ústní či vaginu, kde se také mohou uplatnit jako patogeny Porphyromonas gingivalis  Hnědočerně pigmentované kolonie  Dutina ústní, Urogenitální trakt Prevotella melaninogenica  Černý pigment  Onemocnění HCD (anginy, sinusitidy) Fusobacterium sp.  Polymorfní bakterie (vlákna)  Pleuropulmonární infekce, chronické sinusitidy, mozkové abscesy… Peptostreptococcus sp. Veillonella sp. Diferenciální diagnostika– I  Mikroskopie: Má větší význam než u aerobů, vzhledem k morfologické různorodosti  Kultivace: Je nutno zajistit anaerobiózu pomocí anaerostatů či anaerobních boxů. U tekutých půd postačuje přelití parafinem. Používá se VL bujón, VL krevní agar a různé speciální půdy  Biochemie: kataláza a oxidáza většinou negativní, možné vzájemné rozlišení biochemicky Diferenciální diagnostika– II  Pokus na zvířeti se používá u tetanu a botulismu. U tetanu se myš svíjí v křeči, u botulismu jsou naopak patrné parézy. Tetanická myš Jak získat anaerobiózu www.medmicro.info, photo O. Z. 1) Mechanicky – VL bujony přelijeme parafinovým olejem www.medmicro.info, photo O. Z. 2) Fyzikálně – v anaerobním boxu se nahradí vzduch směsí anaerobních plynů, vháněných z bomby www.medmicro.info, photo O. Z. 3) Chemicky – v anaerostatu se z organických kyselin tvoří vodík a CO2, v druhé fázi na palladiovém katalyzátoru reaguje vodík s kyslíkem za vzniku vody, takže se kyslík spotřebovává ACIDOREZISTENTNÍ BAKTERIE • G+ nepohyblivé krátké rovné či lehce zahnuté tyčky, vzácně větvící se formy • obligátně aerobní, acidorezistentní i alkalorezistentní • dlouhá generační doba (15-20 hodin), růst na speciálních kultivačních půdách několik týdnů (4-6) • vysoce hydrofóbní buněčná stěna s tzv. mykolovými kyselinami, nelze barvit dle Grama • schopnost přežívat uvnitř makrofágů – významnou roli při infekci hraje tedy buněčná imunita • odolné k vysychání a chemickým látkám • patogenní druhy: M. tuberculosis, M. bovis, M.leprae Rod Mycobacterium Původci TBC: • Mycobacterium tuberculosis (Kochův bacil, BK) • M. bovis - tuberkulóza krav, vzácně i lidí – infekce z nepasterizovaného mléka, TBC krčních a mesenteriálních lymfatických uzlin • M. africanum- vzácně, TBC v tropické Africe  Asi 1/3 populace nakažena.  Infekce se projeví jen asi u 10% osob. Tuberkulóza (TBC) I. Primární TBC • Mykobakterie se dostávají do plic (méně často přes zažívací trakt či rány) a zde se množí do rozvoje buněčné imunity, poté dochází k centrální nekróze, vzniká granulom, tzv. tuberkl (lymfocyty, epiteloidní b.), • Mykobakteria se šíří do regionálních mízních uzlin a vytváří se tzv. Primární tuberkulózní komplex • Za klinické příznaky je zodpovědná imunitní reakce organismu Patogeneze onemocnění Další průběh primární TBC: • Spontánní celkové zhojení • Granulom v plicích kaseifikuje či kavernizujelatentní forma • Hematogenní šíření- do různých orgánů. Miliární tuberkulóza- napadá několik míst zároveň (v ledvinách, mozku, kůži a kostech) II. Postprimární TB • U osob infikovaných řadu let po primoinfekci (asi u 10%) • Vzniká za předpokladu: • Exogenní infekce- inhalací mykobakterií • Progrese primární infekce (těžká respirační inf., hladovění, gravidita) • tzv. otevřená tuberkulóza (tuberkulom) • může probíhat bezpříznakově, ale u většiny viditelné symptomy (kašel, hemoptysa, zvýšená teplota, hubnutí,…), zasahuje většinou plíce • Podávání kombinace několika antituberkulotik – zamezení vzniku rezistentních mutant • Nejčastěji používaná: isoniazid, rifampicin, pyrazinamid, ethambutol, streptomycin • Obvykle 4- 12 měsíců- fáze: • Iniciální- snížení počtu bakterií • Pokračovací- sterilizace ložiska • Multirezistentní TB (MDR TB)- onemocnění vyvolané kmenem M. t. rezistentním minimálně ke dvěma základním antituberkulotikům- isoniazid a rifampicin • Očkování- BCG vakcína (bacillus Calmette-Guérin) Léčba TBC Atypická mykobakteria • Podmíněně patogenní mykobakterie (PPM) • Tzv. Mykobakteriózy • Lidská onemocnění: Komplex M. avium, M. kansasii, M. xenopi • Chronická plicní onemocnění, lokalizované lymfadenitidy. Vzácně způsobují infekce ran (fish tank granuloma, swimming pool granuloma), • Některá jiná mykobakteria jsou nepatogenní a jsou normální součástí lidské mikroflóry, např. M. smegmatis Actinomyces israelii • Jsou to anaerobní bakterie vláknité bakterie, v podstatě grampozitivní, ale barví se Gramem špatně, protože jejich buněčná stěna je hodně hydrofobní a obsahuje hodně mykolových kyselin • Běžně se vyskytují v ústní dutině zdravých osob, odtud se za různých okolností mohou dostat do měkkých tkání krku, tváře či hrudníku- aktinomykóza (abscesy) • V poslední době hlavně infekce dělohy u žen s nitroděložními tělísky • G+ aerobní, půdní bakterie • U lidí s oslabenou T-imunitou - lokalizované infekce plic, diseminace - mozkové abscesy • Tropy (N. brasiliensis) – podkožní abscesy Nocardia asteroides • Mikroskopie: Používá se Ziehl-Neelsenovo barvení • Kultivace: Speciální půdy, přičemž před vlastní kultivací předchází moření, obvykle louhem. Cílem moření je usmrtit ostatní bakterie, které by při svém rychlém růstu byly kultivačně úspěšnější. Alkalirezistentní mykobakteria moření přežijí. • Automatická kultivace: Používá se různých typů kultivačních automatů: mohou detekovat kultivační pozitivitu mnohem dříve než klasická kultivace • Biochemické rozlišení je možné, je však vyhrazeno specializovaným laboratořím • PCR diagnostika se stává čím dál důležitější Detekce mykobakterií Úkol 1a: Barvení dle Ziehl-Neelsena • V prvním kroku barvíme karbolfuchsinem za horka až do výstupu par, bez zahřívání by mykobakteria vůbec nešlo obarvit. • V druhém kroku odbarvujeme „kyselým alkoholem“, což je směs alkoholu s minerální kyselinou, nejčastěji HCl • Ve třetím kroku dobarvujeme pozadí, tj. vše, co jsme ve druhém kroku odbarvili. Dobarvujeme malachitovou zelení nebo metylenovou modří. Výsledkem jsou červené acidorezistentní tyčinky na modrém nebo zeleném pozadí Úkol 1b: Mikroskopie mykobakteriální kultury • Před kultivací musí být provedeno moření • Používáme tekutou půdu Šulovu či Baničovu a vaječné půdy Ogawovu či Löwenstein-Jenssenovu. • Dlouhá generační doba (>20 hod) - výsledky se odečítají po 3, 6 a pro jistotu i 9 týdnech kultivace. • Aktinomycety –VLA, za anaerobních podmínek, nokardie KA Úkol 2: kultivace mykobakterií, aktinomycet a nokardií K tekuté Šulově půdě  I pozitivní zkumavka je na první pohled čirá, protože nárůst mykobakterií je patrný jen u dna • Nelze používat difúzní diskové testy • Antituberkulotika přidáváme přímo do kultivační půdy • Antituberkulotika jsou zvláštní látky, až na výjimky odlišné od antibiotik • Vždy se užívají kombinace tří či čtyř: rychle totiž vznikají rezistence, navíc některá působí jen intraa jiná zase extracelulárně • Mykobakterium roste  je rezistentní • Mykobakterium neroste  je citlivé Úkol 3: testy antituberkulotické citlivosti Test uvolnění interferonu gama (Quantiferon© TB-GOLD) • Moderní možností k ověření buněčné imunity je vyšetření indukovaného uvolňování interferonu gama, v praxi se používá prakticky výhradně komerčně dostupný test Quantiferon TB-GOLD, proto budeme dále hovořit jen o něm • Bylo prokázáno, že při tuberkulóze, a to i latentní, dochází k tomu, že tuberkulózní antigeny aktivují Tlymfocyty a ty tvoří velká množství interferonu gama • Podobně lze tyto T-lymfocyty aktivovat nespecificky např. takzvaným mitogenem, ten se proto používá jako pozitivní kontrola Quantiferon – tři zkumavky • Odebírá se nesrážlivá krev do tří zkumavek (potřebujeme lymfocyty!) • první zkumavka obsahuje mitogen (MIT) – zde by mělo za normálních okolností vždy dojít ke stimulaci tvorby interferonu gama • druhá zkumavka obsahuje antigeny TBC (TB) – zde by mělo dojít ke stimulaci tvorby interferonu gama pouze u infekce TBC • třetí zkumavka neobsahuje nic (NIL) – zde by za normálních okolností nemělo docházet ke stimulaci tvorby interferonu gama Quantiferon – hodnocení • Za pozitivní lze považovat výsledek, kdy Tlymfocyty reagují na stimulaci antigenem mykobakteria, avšak ve zkumavce NIL nedochází k tvorbě inferferonu • Za negativní lze považovat výsledek, kdy Tlymfocyty reagují na stimulaci mitogenem, ale nereagují na stimulaci antigenem mykobakteria • Neurčitý výsledek se objeví v případě, že Tlymfocyty nejsou aktivovány ani mitogenem, nebo naopak se tvorba interferonu objeví i ve zkumavce, kde nic nebylo Úkol 6: Interpretace výsledku testu Quantiferon TB Gold Pomocí tabulky ve svém protokolu se pokuste interpretovat následující výsledky testu Quantiferon TB Gold examination u čtyř pacientů:  Anna: MIT = 4,8 TB = 1,2 NIL = 1,1  Berta: MIT = 5,3 TB = 4,8 NIL = 2,1  Cecil: MIT = 0,9 TB = 0,9 NIL = 0,8  Dimos: MIT = 8,4 TB = 8,3 NIL = 8,2 (všechny hodnoty jsou uvedeny IU/ml) Úkol 11: mikroskopie vzorků  Podezřelé kmeny již jsou obarveny podle Grama  Rozlišíte bakterie podle tvaru a typu buněčné stěny. Pro vzájemné rozlišení musíte samozřejmě pokračovat dál  Anaerobní tyčinky jsou někdy velice různotvaré – v jednom preparátu najdete útvary od vláknitých až po prakticky kokovité Úkol 12a: Anaerostat vzduchotěsné víčko palladiový kalalyzátor (pod víčkem) konstrukce pro ukládání Petriho misek Generátor anaerobiózy (sáček s chemikáliemi) šroubovací uzávěr tlakový ventil www.medmicro.info, photo O. Z. Úkol2b:Anaerobníbox www.medmicro.info, photo O. Z. zdroj anaerobních plynů prostor pro vkládání misek vstupy pro ruce personálu Úkol 13: Kultivace bakterií  Zjistěte, kde co roste, a to co roste, popište.  Všimněte si, že anaerobní bakterie rostou často v drobných, nepravidelných koloniích, které mají někdy výběžkaté okraje. Typický je pro ně také značný zápach.  Úkol 3a: Aerobní kultivace na krevním agaru umožňuje růst striktně aerobních a fakultativně anaerobních bakterií. Když tu tedy bakterie neroste, avšak roste na anaerobních půdách, je to striktní anaerob. Úkol 15 – testy antibiotické citlivosti  Antibiotická citlivost se u anaerobů určuje na půdách, na kterých jsou schopny růst, tj. nikoli na MH agaru, ale zpravidla na VL krevním agaru  Lékem volby u většiny anaerobů je opět klasický penicilin. Rezistentní je však rod Bacteroides (rody Prevotella a Porphyromonas, které se z něj kdysi odštěpily, jsou citlivé) Úkol 16c: Imunochromatografický průkaz toxinu C. difficile  Imunochromatografické testy jsou založeny na navazování jednotlivých komponent, podobně jako u reakcí ELISA či a imunofluorescence  Nejklasičtějším příkladem je těhotenský test  Týká se především kmenů Clostridium difficile produkujících toxin. V pozitivním případě je zpravidla viditelný proužek reakce i proužek kontroly . V negativním případě je viditelný pouze proužek kontroly.