P09
Spirochety
Spirochety
 Rod Borrelia, Treponema, Leptospira
 Spirální bakterie, pohyblivé pomocí intracelulárních
bičíků (penetrace tkáněmi, ochrana před fagocyty)
 Jejich buněčná stěna je blízká gramnegativní, ale
podle Grama se nebarví
 Mikroskopovat je lze pouze pomocí zástinu,
fluorescence anebo imunofluorescence
 Spirochety se obecně prakticky nedají kultivovat
Borrelie
 Původci lymské boreliózy (Borrelia
burgdorferi sensu lato)
 Borrelia burgdorferi sensu stricto (postižení
kloubů a myokardu)
 B. afzelii (kožní příznaky)
 B. garinii (neuroborelióza)
 B. lusitaniae, B. japonica, B. bissetti
 Původci návratných horeček
(B. reccurentis, B. duttoni, B. hermsii)
Lymeská borelióza
 Zoonóza
 Přenos členovci, především
klíšťaty ( u nás Ixodes ricinus)
 Rezervoár: středně velcí a malí
savci, hlodavci
 Incidence v ČR: 40-60/100 000 ob.
 Protilátky nalézáme u 10 % zdravých osob
 Prodělané onemocnění chrání
jen částečně
 Lék volby: peniciliny,
tetracykliny
Infekce probíhá ve 3 fázích:
 Časné lokalizované st.
- erythema migrans
- nespecifické příznaky
 Časné diseminované st.
- borreliový lymfocytom (nejčastěji na ušních boltcích)
- neurologické, revmatologické či kardiální projevy
 Pozdní diseminované st.
- únavnost
- acrodermatitis chronica atrophicans - papírově
ztenčená kůže (končetiny, trup, obličej)
- encefalitida, artritida, kardiomyopatie
Průkaz
 Borrelie:
• Především sérologie, popř. PCR
• Sérologii se stanovují IgM (svědčí pro
časnou infekci) a IgG protilátky metodou
ELISA
• Pozitivní nález se ověřuje Western blotem,
ten je specifičtější metodou
Treponema pallidum
 Původce syfilis (poddruh T. pallidum subsp.
pallidum)
 Syfilis je klasická pohlavní nemoc, přenáší se
výhradně sexuálně.
 Některé poddruhy T. pallidum a některá jiná
treponemata způsobují jiné choroby (framboesie –
yaws, T. pallidum subsp. pertenue)
 Některá treponemata jsou i nepatogenní- na
sliznicích dutiny ústní a genitálu
Průběh syfilis
 Časná syfilis
• Primární syfilis (ulcerace na genitálu- tvrdý vřed)
• Sekundární syfilis (diseminace, nespecifické
symptomy, generalizovaná vyrážka, condylomata
lata, lymfadenopatie)
• Časná latentní syfilis (asymptomatická, relapsy
sekundární fáze)
 Pozdní syfilis
• Latentní syfilis (cca 3-20 let)
• Terciální syfilis (gummata, kardiovaskulární
lues, neurosyfilis, tabes dorsalis)
 Vrozená syfilis
Treponemata: přímý průkaz
 Přímý průkaz se dělá zřídka
 Mikroskopie: Používá se nativní preparát – zástin,
mimo to lze provést fluorescenční barvení
 Kultivace ani biochemická identifikace se
nepoužívají
 Průkaz antigenu lze provést přímou IMF
 Pokus na zvířeti: Existuje tzv. RIT – Rabbit
infectivity test (test infekčnosti na králíkovi)- raritní
 PCR diagnostika se stává čím dál důležitější
Treponemata: nepřímý průkaz
 Používají se netreponemové testy, kde antigenem je
zpravidla kardiolipin a treponemové testy, kde antigen je
získán opravdu z Treponema pallidum
 Diagnostika se skládá ze screeningu a konfirmace.
Konfirmuje se vše, co ve screeningu vyšlo pozitivní či aspoň
hraniční, a dokonce i to, co bylo negativní, je-li důvod
 Screeningově se zpravidla použije jeden netreponemový a
jeden treponemový test, konfirmace se provádí pomocí
velmi spolehlivých treponemových testů
 Indikací ke konfirmaci je:
 jakýkoli pozitivní či alespoň hraniční výsledek reakce RRR a/nebo
TPHA
 přítomnost suspektních lézí na těle, nebo anamnéza rizikového
sexuálního styku – zde i v případě negativity obou reakcí
Přehled nejdůležitějších
nepřímých testů na lues
Screeeningové RRR – Rapid Reagin Test
Netr.
TPHA
Treponemové
Konfirmační ELISA
FTA-ABS (nepř.
imunofluorescence)
Western Blot
TPHA – T. pallidum pasivní hemaglutinační test
Rod Leptospira
 Jemné pravidelné závity, na koncích háčkovitě ohnuté
 Způsobují zoonózy- tzv. leprospirózy, člověk se nakazí
kontaktem s močí infikovaného zvířete (myšovití
hlodavci, prase, skot)- koupání, konzumací
kontaminované vody či potravy
 Blaťácká horečka (serovar Grippotyphosa )chřipkovité
příznaky, dobrá prognóza
 Weilova choroba (serovar Icterohemorragiae)- 1.
fáze podobná blaťácké horečce, ve 2. fázi nastupuje
ikterus, renální selhání, krvácivé projevy na kůži a
sliznicích
Průkaz
 Leptospiry:
• Používá se zástinová
mikroskopie a kultivace
ve speciálním médiu,
PCR
Borrelie: úvod k úkolům 1 až 3
 Máme pět pacientů, kteří z různých důvodů
přicházejí k vyšetření na borreliózu.
 Pacient J: klinicky definované erythema migrans
(jasný obraz, ne jen podezření)
 Pacient K: cítí se ospalý, v létě měl klíště; jiné potíže
nejsou přítomny
 Pacient L: neurologové nalezli typické klinické
příznaky neuroboreliózy
 „Pacient“ M: zdravá osoba, ale v létě měl klíště, a
cítí se ohrožen rizikem borreliózy, protože si přečetl o
tomto riziku.
 Pacient N: je u něj podezření na neuroboreliózu,
avšak není to jasné
Úkol 1: ELISA – Borrelia
 Průkaz protilátek proti Borellia garinii
 Máte k dispozici výsledky reakce ELISA ve
formě hodnot absorbance
 Pozitivní jsou pacienti s hodnotami vyššími
nežli hodnota v kalibračním důlku (CAL). Ten
se nachází v pozici A1, B1 a C1 jsou kontroly
 Prověřte výsledky pacientů J, K, L, M, N ve
třídách IgG i IgM
Pacienti – ELISA, jak jdou po
sobě jednotlivá čísla pacientů:
CAL 6 J 22 30
K+ 7 K 23 31
K- 8 L 24 32
1 9 17 25 N
2 10 18 26 34
3 11 19 27 35
4 12 20 28 36
5 13 M 29 37
CAL 6 J 22 30
K+ 7 K 23 31
K- 8 L 24 32
1 9 17 25 N
2 10 18 26 34
3 11 19 27 35
4 12 20 28 36
5 13 M 29 37
IgM IgG
Úkol 2: Borrelie – konfirmace WB
 Konfirmují se pouze pacienti pozitivní v reakci
ELISA, nebo indikovaní z klinických důvodů. V
našem případě jsou to však všichni pacienti J, K, L,
M, N (všichni byli v reakci ELISA pozitivní, s
výjimkou pacienta J, který však má erythema
migrans, takže je bez ohledu na negativitu ELISA
indikován ke konfirmaci.
 Pozitivita WB je definována následovně:
 u IgM považuje pozitivita v pruhu p 25, OspC
 u IgG považuje pozitivita v pruhu VlsE
 Odečtěte tedy výsledky IgG i IgM u našich
pacientů.
Úkol 3: Borrelie – PCR
 PCR je reakce přímého průkazu, je tedy
průkaznější než hledání protilátek, zvlášť u
čerstvé infekce
 K reakci PCR jsou indikováni z našich pacientů
pouze pacienti L a N.
 Zjistěte, který pacient je pozitivní
 Pozitivita = svítí proužek detekované reakce
 Interní kontroly tentokrát nebyly použity
 Úplně vpravo je ladder (hmotnostní měřítko)
Závěr k úkolům 1 až 3
 J: Nutno léčit doxycyklinem (i přesto, že je
seronegativní, klinické příznaky jsou dostatečně
pádným důvodem k léčbě)
 K: Zřejmě jen paměťové protilátky, nutná další
diferenciální diagnostika
 L: Skutečně jde o neuroboreliózu, léčba
ceftriaxonem
 M: Pacient je v pořádku (kdysi možná prodělal
bezpříznakovou borreliózu, 10 % populace má
pozitivní IgG)
 N: pozitivní IgM v ELISA nepotvrdil WB ani PCR,
zřejmě zkřížená reakce, nutno pátrat po jiných
neuroinfekcích
Úkol 4: Přímý průkaz syfilis
 4b- mikroskopie v zástinu– prohlédněte si
obrázky a obkreslete si je do protokolu (princip i
vzhled Treponema pallidum)
 4c- přímá IMF – prohlédněte si ještě další
obrázek a zakreslete výsledek přímé
imunofluorescence
4b Zástinová mikroskopie
Pouze paprsky lomící se na preparátu
dopadají do oka pozorovatele. A proto
oko pozorovatele vidí temné pole* se
zářícím(-i) objektem(-y)
*anglicky dark field,
z toho anglický
název zástinové
mikroskopie „dark
field microscopy“
4c Imunofluorescence www.medmicro.info
Úkoly 5 a 6: Serologie syfilis
(screening a konfirmace )
 V úkolu 5 vybereme ze screeningových pacientů ty,
které je třeba konfirmovat
 V úkolu 6 potvrdíme jejich diagnózu a učiníme konečný
závěr
 Pracujeme s pěticí pacientů:
 A = těhotná žena (běžný screening, není zvýšené
riziko syfilis
 B = pacient s dva dny trvající lézí, která vypadá jako
ulcus durum
 C = pacient se suspektní lues latens
 D = dárce krve (pouhý screening)
 E = dítě s pravděpodobnou vrozenou syfilis
Úkol 5: RRR a TPHA
 U RRR je pozitivní důlek se zákalem (vypadá
podobně jako pozitivní kontrola)
 TPHA: Prohlédněte si panel na bočním stole.
Vyhodnocení pacientů A, B, C, D, E proveďte
dle obrázku na následující obrazovce
TPHA
• Pozitivní – vzniká aglutinát, při pohledu
shora chuchvalec nepravidelného tvaru
• Negativní –klesají na dno a vytvářejí denzní
pravidelnou kulatou tečku při pohledu shora
+++ ++ + +/-
- - Pozitivní
kontrola (různá míra pozitivity)
Pacienti (1, 2, 3)
Připomenutí
TPHA
Negativní kontrola
Technické důlky
Kontrola
Vlastní reakce
TPHA – hodnocení:
Výsledky – screening
RRR TPHA závěr
A + 0 konfirmace
B 0 0 konfirmace*
C 0 +++ konfirmace
D 0 0 konfirmace není nutná
E + +++ konfirmace
*Výsledek je sice negativní, ale konfirmační reakce budou
provedeny s ohledem na klinickou situaci
Úkol 6: Konfirmace syfilis
Konfirmační reakce I
Výsledky reakce FTA-ABS:
A B C D
E konfirmace se
neprovádí
Konfirmační reakce II
 Hodnocení ELISA reakce:
• Nejprve spočítejte cut off a nahraďte otazníky
• c. o. = (C1 + D1)/2
• IgG: Hodnoty vyšší než ??? jsou pozitivní
• IgM: Hodnoty vyšší než ??? jsou pozitivní
 Hodnocení Western blottu
 Za pozitivní v IgG i v IgM považujte všechny pásky,
na kterých umístění a uspořádání proužků zhruba
odpovídá pozitivní kontrole
Konfirmační reakce III
 Hodnocení ELISA reakce:
• IgG: Hodnoty vyšší než 0,366 jsou pozitivní
• IgM: Hodnoty vyšší než 0,494 jsou pozitivní
 Hodnocení Western blottu
• Za pozitivní v IgG i v IgM považujte všechny
pásky, na kterých umístění a uspořádání proužků
zhruba odpovídá pozitivní kontrole
Výsledky - konfirmace
FTA-
ABS
IgM IgG
Závěr
ELISA WB ELISA WB
A 0 0 0 0 0 Nejde o lues. Asi falešně
+ (např. po očkování)
B 0 0 0 0 0 PCR nutné. U čerstvé inf.
je možná seronegativita
C + 0 0 + + Opravdu jde o lues
latens, jak se
přepokládalo.
D konfirmace neprovedena Dárce je v pořádku
E +++ + + + + Jde o kongenitální syfilis.
Vyšetříme také krev
matky.
Úkol 7:
diagnostika
leptospir
 Prohlédněte si
obrázek a
obkreslete jej