SEROLOGICKÉ METODY Metody lékařské mikrobiologie • Přímé metody: detekce mikroba, jeho části nebo produktu. Příklady: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita = je jisté, že agens je NYNÍ přítomno. • Nepřímé metody: detekce protilátek proti mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal hostitele v minulosti (nevíme, zda před týdny / měsíci / roky) Serologické reakce Reakce mezi antigenem a protilátkou in vitro Antigen = makromolekula pocházející z.cizího organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha. V mikrobiologii nás zajímají mikrobiální antigeny = části mikrobiálního těla, které vzbuzují v.hostiteli antigenní odpověď Protilátka = imunoglobulin, tvořený v.těle hostitele (člověka, ale také zvířete) jako odpověď na antigenní výzvu Dva způsoby, jak využít interakci mezi antigenem a protilátkou: Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu)+ vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda Interpretace • Průkaz antigenu je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta • Průkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal: – Množství protilátek (relativní – titr) a jeho změny v čase (dynamika titru) – Třída protilátek: IgM/IgG Jak interpretovat nepřímý průkaz • Akutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM, případně IgM i IgG • Pacient po prodělané infekci: malé množství protilátek, pouze IgG (imunologická paměť) 1 1 2 2 Průběh protilátkové odpovědi • Protilátky IgM se tvoří jako první, ale také jako první mizí. Neprocházejí placentou, jejich průkaz u novorozence je svědectvím jeho infekce • Protilátky IgG se tvoří později a zůstávají jako paměťové přítomny dlouhodobě. Procházejí placentou (novorozenec je tedy může mít od matky) Protilátky ostatních tříd • Protilátky třídy IgA se u některých infekcí vyšetřují místo protilátek IgM. Tato třída se uplatňuje hlavně u slizniční imunity, a tedy u infekcí, kde branou vstupu je sliznice (například gastrointestinální) • Protilátky třídy IgE se vyskytují u alergií a infestací červy. Zpravidla se však nestanovují specifické IgE proti nějakému patogenovi • S protilátkami IgD se v mikrobiologii nepracuje Titr • Nejvyšší ředění, kde ještě vidíme pozitivní reakci, se nazývá titr. Dynamika titru • Každý má jinou úroveň protilátkové odpovědi. Proto samotná hodnota titru mnoho neříká • Změna titru vypovídá více. Jde-li o čerstvou záležitost, titr se vždy vyvíjí, nejprve stoupá, později zvolna klesá. Proč nestačí samotný titr Někdy se stane, že málo reaktivní pacient má i v akutní fázi titr dosti nízký Velmi reaktivní pacient naopak i dlouho po infekci titr relativně vysoký Párová a nepárová séra • Párová séra = první vzorek je uchováván v.ledničce, dokud nepřijde i druhý (10–14 dní). Pak jsou oba hodnoceny naráz. čtyřnásobný vzestup se v tom případě má za signifikantní pro akutní infekci. • Séra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto zpravidla vyžadujeme osminásobný vzestup titru • Zvláštním případem je tzv. serokonverze – v prvním vzorku protilátky nejsou (ještě se nestihly vytvořit), v druhém už jsou. Takový důkaz je cennější než „důkaz čtyřnásobkem“ • V některých případech místo vzestupu prokážeme pokles (subakutní infekce) • Velikost titru rozhodně neodpovídá vývoji klinických příznaků. Množství protilátek často vrcholí, až příznaky zmizí. 1. PRECIPITACE, AGLUTINACE, AGLUTINACE NA NOSIČÍCH Precipitace a aglutinace • Precipitace a aglutinace jsou dvě nejjednodušší serologické reakce, kde pracujeme opravdu jen s antigenem a protilátkou bez dalších složek • Buďto tedy dokazujeme antigen zvířecí protilátkou, nebo protilátku laboratorním antigenem • Pouze ve druhém případě zjišťujeme titry! Precipitace: Antigeny jsou ve formě izolovaných makromoleku l (jde tedy o koloidní antigen) antigen protilátka Aglutinace: Antigen je součástí buňky mikroba (pracujeme tedy s.celými mikroby, říkáme, že antigen je korpuskulární) •Aglutinace na nosičích: Původně izolované antigeny jsou navázány na cizí částici – nosič (latex, erytrocyt, polycelulóza) Aglutinace • Pozitivní – nepravidelný chuchvalec • Negativní – malé pravidelné kolečko Treponema pallidum pasivní hemaglutinace (TPHA) Pozitivní reakce je vznik „chuchvalce“, negativní sedimentace částic na dno důlku. Je to červené, jedná se totiž o aglutinace na nosiči, nosičem je erytrocyt +++ ++ + +/- - - Pozitivní kontrola (různá míra pozitivity) Pacienti (1, 2, 3) TPHA Negativní kontrola Technické důlky Kontrola Vlastní reakce 2. KOMPLEMENTFIXAČNÍ REAKCE Komplementfixace (KFR) • Komplement = jedna ze složek imunitní reakce • Pro KFR používáme morčecí komplement. Pacientův komplement je před reakcí inaktivován teplem • Komplement není schopen vázat se na samotný antigen • Komplement není schopen vázat se na samotnou protilátku • Komplement je schopen vázat se pouze na KOMPLEX obou Použití KFR • KFR lze použít pro diagnostiku mnoha, zejména virových infekcí • Jako i jiné serologické reakce se KFR používá k průkazu antigenu či protilátky • Pro zjednodušení uvádíme pouze průkaz protilátky- máme laboratorní antigen, který konfrontujeme se sérem pacienta (kde hledáme protilátky) Princip KFR • Sérum pacienta se smíchá s laboratorním antigenem • Přidá se komplement. V pozitivním případě se naváže (komplex Ag-Ab) • Ve druhé fázi přidáme indikátorový systémberaní ery + amboceptor (králičí Ab proti beraním erytrocytům) • U pozitivní reakce zůstává indikátor nedotčen, v opačném případě dojde k jeho hemolýze Komplement a jeho vlastnosti http://web.indstate.edu/thcme/ micro/comp_fix.gif Pozitivní reakcezábrana hemolýzy Negativní reakce- hemolýza 3. NEUTRALIZAČNÍ REAKCE Neutralizační reakce • Protilátka často dovede neutralizovat či inhibovat určitou biologickou vlastnost antigenu • Tento způsob se zřídka vidí u celých bakterií. Pozorujeme ho u virů nebo bakteriálních toxinů ASLO (antistreptolyzin O) • Po každé streptokokové infekci se objevují protilátky, včetně protilátek proti streptokokovému toxinustreptolyzinu O • Někdy se stane, že množství těchto protilátek po infekci neklesá, ale naopak stoupá. • V takovém případě jsou tedy nebezpečnější protilátky než samotný patogen • ASLO není přímý průkaz, nepátráme po patogenovi, určujeme samotné protilátky • Indikací k vyšetření je podezření na tzv. pozdní následky streptokokových infekcí (akutní glomerulonefritida a revmatická horečka) ASLO- princip • Protilátka blokuje hemolytický efekt toxinu (streptolyzin O) na krvinku. Pozitivní je tedy zábrana hemolýzy se sedimentací krvinek (podobně jako u KFR, ale ze zcela jiného důvodu) • Panel s pozitivní kontrolou a sedmi pacienty, ředění s koeficientem pouze 1,2 • Titr nad cca 200 znamená riziko, že pacient je ohrožen pozdním následky streptokokové infekce Princip vyšetření ASLO: neutralizace hemolýzy 4. REAKCE SE ZNAČENÝMI SLOŽKAMI Reakce se značenými složkami • Na povrch (sklíčko, důlek mikrotitrační destičky,…) se postupně navazují jednotlivé složky • Místo jedné ze složek se pokusíme navázat vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že danou složku možná obsahuje • Je-li to pravda, složka se naváže • Pokud se všechny složky postupně navážou, vznikne nepřerušený řetězec • Na konci řetězce je vhodné značidlo Příklad pozitivního a negativního průběhu Laboratorní protilátka Hledaný antigen Antigen chybí Značená laboratorní protilátka (detekce) Značená laboratorní protilátka + – Není navázaná  je odplavena  nemůže být detekována POVRCH (sklíčko nebo dno důlku v destičce pro serologii) Pacientův vzorek Laboratorní protilátka Typy značidel • Fluorescenční barvivo je značidlem u imunofluorescence • Radioizotop je značidlem u reakce RIA • Enzym je značidlem u reakce ELISA Western blotting je zvláštním případem reakce ELISA, kde jednotlivé antigeny jsou elektroforeticky rozděleny Používáme-li jako značidlo enzym, je poslední složkou přidanou do reakce ještě příslušný substrát – tedy jeden krok navíc. Promytí a jeho význam • Pokud by v reakci zůstalo přítomno i to, co se na nic nenavázalo, nedokázali bychom odlišit pozitivní reakci od negativní • Proto po každém kroku reakce následuje promytí, po kterém zůstanou přítomny pouze složky navázané na pevný povrch • Je-li řetězec přerušen, odplaví promytí vše za místem přerušení I. Imunofluorescence www.biologie.uni-hamburg.de Odečítá se pomocí fluorescenčního mikroskopu www.amsbio.com přímá imuofluorescence (Povrch)-(antigen)-(značená protilátka) nepřímá imunofluorescence (Povrch)-(antigen)-(protilátka)-(značená protilátka proti lidské protilátce) II. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ELISA – praktické provedení • Zpravidla máme k dispozici destičku s.jamkami. Na rozdíl od klasických serologických reakcí má každý pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto, že nezjišťujeme titry • Před vlastními důlky pacientů mohou být důlky: –Bl – blank (pro kalibraci spektrofotometru) –K- a K+ – pozitivní a negativní kontrola –Cut off (dva či tři důlky) – výrobcem dodané „vzorky“ s.právě hraniční hodnotou absorbance („odsekávají“ pozitivní výsledky buď ostře, nebo s rozmezím plus mínus 10 %) ELISA – proč je tak oblíbená • U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví jednoduše: intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá. Sytá barva = vysoce pozitivní. ELISA k detekci protilátky: 1. Pozitivní (hledá se IgM, IgM přítomna) Všechny složky se postupně navazují. Dojde k.enzymatické reakci – změně barvy v důlku ELISA k detekci protilátky: 2. Negativní I (hledá se IgM, žádné protilátky) V séru pacienta nejsou protilátky. Konjugát je odplaven, v důlku není žádná změna. ELISA k detekci protilátky: 3. Negativní II (hledá se IgM, přítomny IgG) V séru pacienta jsou jen IgG protilátky. Konjugát je odplaven, ke změně barvy důlku nedojde 3.Western blotting • Prakticky je to ELISA, ale směs antigenů je rozdělena elektroforeticky na jednotlivé antigenní determinanty • Je tedy přesnější a pomáhá zejména tam, kde klasická ELISA troskotá na zkřížené pozitivitě např. příbuzných mikroorganismů Western blot – vzhled (obrázek z www.medmicro.info) Možnosti uspořádání složek • Povrch-antigen-protilátka-značidlo (P) • Povrch-protilátka-antigen-protilátkaznačidlo (P, např. průkaz HBsAg) • Povrch-antigen-protilátka-antigenznačidlo (N) • Povrch-antigen-protilátka-konjugátznačidlo (N) Konjugát je značená protilátka namířená proti lidské protilátce Význam konjugátu • Konjugát se používá zpravidla u reakcí nepřímého průkazu (průkaz protilátek) • Je to protilátka, pro kterou je antigenem lidská protilátka např. IgM nebo IgG • Dokáže být selektivní proti určité třídě lidské protilátky • Použití konjugátu je tedy podstatou možnosti selektivního průkazu jednotlivých tříd protilátek Úkoly +++ ++ + +/- - - Pozitivní kontrola (různá míra pozitivity) Pacienti (1, 2, 3) Aglutinace na nosičích- TPHA Negativní kontrola Technické důlky Kontrola Vlastní reakce Princip KFR Problémy s KFR • Příliš mnoho komplementu  falešná negativita. Co dělat? Titrovat komplement • Některá složka séra sama o sobě vyvazuje komplement (složka antikomplementarity): falešně pozitivní výsledky. Co dělat? Provést test antikomplementarity bez antigenu Test antikomplementarity KFR: Respirační patogeny • Celá serologická destička patří jednomu pacientovi. • Máme šest respiračních patogenů, každý je ve dvou řádcích (akutní vzorek a rekonvalescentní). • První sloupec je test antikomplementarity • Následuje sedm ředění séra – ve druhém sloupci 1 : 5 a pak geometrickou řadou s.koeficientem dva. Kromě virů je ve škále i bakterie Mycoplasma pneumoniae Testovaná agens • Chřipka A (řada 1 + 2) • Chřipka B (řada 3 + 4) • Parachřipka (řada 5 + 6) • RS virus (řada 7 + 8) • Adenovirus (řada 9 + 10) • Mycoplasma pneumoniae (řada 11 + 12) • První vzorek séra (když pacient přišel poprvé): 1, 3, 5, 7, 9, 11 • Druhý vzorek séra (po 10–14 dnech): řady 2, 4, 6, 8, 10, 12 Výsledky • I: titr = 1 : 5 • II: titr = 1 : 5 • Interpretace: Protilátky jsou přítomné, ale titr je nízký a nemění se  náš pacient se s patogenem v životě setkal, ale není nakažený právě teď. • vzorek I: titr = 1 : 5 • vzorek II: titr = 1 : 10 • Interpretace: Titr se zvýšil, ale dvojnásobný vzestup titru může byt náhodný, není signifikantní pro akutní infekci. • I: Titr = 1 : 10 • II: Titr = 1 : 160 • Interpretace: 16-násobný vzestup titru. Náš pacient je vysoce podezřelý z infekce tímto patogenem. ASLO – vyhodnocení úkolu • Pozitivní kontrola je opravdu pozitivní • Vysoké riziko pozdních následků je u pacientů s titry 506, resp. 337 m. j. • Hraniční riziko je u pacienta s titry 225 m. j. a 180 m. j. ELISA, průkaz protilátek  U nepřímého průkazu reakcí ELISA se zpravidla hodnotí zvlášť protilátky IgM a IgG  V daném případě se místo IgA používá IgM  Za pozitivní se opět považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“  V našem případě se cut off počítá jako (B1 + C1)/2 + 0,320 v případě IgA, resp. (B3 + C3)/2 + 0,320 v případě IgG  Výsledky mezi 90 % a 110 % cut off se hodnotí jako „hraniční“, pod 90 % jako „negativní“, nad 110 % jako „pozitivní“