3. úloha. Konjugace kmenů Escherichia coli Hfr a F' Konjugace je proces, při kterém je DNA přenášena z donorové buňky do recipientní v důsledku kontaktu buněk a vytvoření konjugačního můstku. Uskutečnění konjugace lze dokázat vznikem rekombinantů, které nemohly vzniknout jinak, než rekombinací mezi genomem donorového a recipientního kmene. Konjugace u E. coli je závislá na přítomnosti a stavu F faktoru. F je plazmid (94,5 kb), který se může autonomně replikovat v buňce nebo integrovat do hostitelského chromozómu. Podle stavu F faktoru se označují příslušné kmeny: Označení Stav F faktoru F F faktor není přítomen v buňce F+ F faktor je přítomen v cytoplazmě F' F faktor nese segment bakteriálního chromozómu Hfr F faktor je integrován do bakteriálního chromozómu Vlastnosti Vhodný recipient během konjugace. Může být přenášen konjugací do recipientní buňky; přenos chromozomálních genů může zprostředkovat při velmi nízké frekvenci. Může být přenášen spolu s asociovaným bakteriálním segmentem chromozómu; může zprostředkovat přenos chromozomálních genů při střední frekvenci v důsledku integrace do chromozómu v homologických oblastech Může přenášet chromozomální znaky při vysoké frekvenci (od pevného bodu na chromozómu, který je charakteristický pro každý Hfr) Objekt: Donor: Escherichia coli HfrH Reich tre+ leu+ pro+ ade+ thi" str5 Recipient: Escherichia coli F" 28R801 tre" leu" pro" ade" thi" stť Do recipientních buněk přechází segment tre+ leu+ pro+ ade+ thi". Marker str zůstává v endogenotu. Postup: 1. Příprava mladých kultur donorového a recipientního kmene: Naočkovat 1 kličku do 20 ml PNS média a inkubovat při 37 °C 18 hodin (do log. fáze růstu). 2. Smíchat kultury donorového a recipientního kmene v poměru 1 : 1 (5 ml + 5 ml) a inkubovat za aerace (při šetrném míchání na vodní lázni) při teplotě 37 °C 3 hodiny. 3. Současně stanovit titr donorového kmene HfrH rozsevem na plotny MPA ve zředění 10"5, 10"6, 10"7, vždy po 3 plotnách. 4. Přesvědčit se, že ani kmen HfrH ani F " nerostou na selektivní půdě. Kontrolu provést výsevem po 0,1 ml kultury zředěné 10"1 na 3 plotny MA + streptomycin 100 |lg/ml + thiamin 5 |lg/ml. Ředění provádět ve fyziologickém roztoku! 5. Po 3 hodinách inkubace vyset neředěnou směs na selektivní půdu po 0,1 a 0,2 ml (vždy po 3 plotnách). 6. Hodnocení pokusu: vyjádřit frekvenci rekombinantů na počet buněk Hfr. Živné půdy: PNS bujón půda pro konjugaci glukóza lg Bacto beef extract 1,5 g Yeast extrakt 1,5 g pepton 5g NaCl 3,5 g K2HP04 3,68 g KH2P04 1,32 g H20 dest. 1000 ml pH 7,2 (i autoklávovat 20 min. /121 °C MPA masopeptonový agar (kompletní půda) MA minimální agar: složka A 1,5% vodní agar, pH 7,2 složka B (4 x koncentrovaný roztok solí) NH4C1 20 g NH4N03 4g Na2S04 8g K2HP04 12 g KH2P04 4g H20 dest. 1000 ml MgS04- 7H20 1,6 ml po autoklávování složka C 20% glukóza - přidat lml na 100 ml MA složka D streptomycin - přidat do konečné koncentrace 100 |lg/ml ze zásobního roztoku 100 mg/ml složka E thiamin přidat do konečné koncentrace 5 |lg/ml ze zásobního roztoku 50 mg/ml Při přípravě MA smíchat složky B (1 díl) + C + D + E, vytemperovat na 45 °C a smíchat se složkou A (3 díly). Příprava minimálního agaru na konjugaci SLOŽKA A vodní agar 180 ml vytemperovat na 47 °C SLOŽKA B roztok solí 60 ml vytemperovat na 47 °C { SLOŽKA C glukóza 2,5 ml SLOŽKA D streptomycin 100 |ag/ ml SLOŽKA E thiamin 5 jag/ ml KONJUGACE Kontrpla na MA + str + thi 10 ředit ve fyziol. rozt. 1 plotna (0,1 ml) Kontrpla na MA + str + th 10 ředit ve fyziol. rozt. 1 plotna (0,1 ml) E. coli HfrH Reich 5 ml Ufr na6LBA 7 10 ,10 ,10 po 3 plotnách (po 0,1 ml) E. coli F- 28R801 5 ml KONJUGACE 37 °C / 3 hod / šetrně třepat I Vysev na MA + str + thi neředěné 3 plotny (0,1 ml) + 3 plotny (0,2 ml)