Pulzní gelová elektroforéza Při konvenční gelové elektroforéze je rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou strukturou gelové matrice. Tento princip separace se uplatňuje u molekul DNA do velikosti přibližně 50 kb. Větší molekuly se pohybují stejnou rychlostí a nerozdělí se. K jejich separaci se využívá pulzní gelová elektroforéza. Gel vystaven elektrickému poli, jehož směr se pod určitým úhlem (90-180°) v časových intervalech periodicky mění. Aby se molekuly DNA mohly pohybovat ve směru změněného elektrického pole, musí nejdříve změnit svou orientaci. Větší molekuly DNA spotřebují na svou reorientaci více času než molekuly menší a jejich výsledný přímočarý pohyb je proto pomalejší. Techniky pulzní elektroforézy se využívá k separaci neporušených molekul DNA (např. chromozomů kvasinek) nebo restrikčních fragmentů o velikosti několika megabází. Základní termíny týkající se PFGE f~"~i r~~« t—; |—; \ j i—j ;—\ r~—i r~~] Pulzní pole (pulsed field). Elektroforetický proces, který používá více než jedno elektrické pole, a ve kterém se elektrická pole střídavě aktivují. Pulzní interval (switch interval, switch time, pulse time). Čas, po který je každé ze střídajících se elektrických polí aktivováno. Reorientační úhel (reorientation angle). Úhel mezi dvěma střídajícími se elektrickými poli, tj. úhel mezi různými směry, ve kterých molekuly DNA putují. Homogenní pole (homogeneous field). Elektrické pole, které má uniformní potenciálové rozdíly po celém poli. Princip separace molekul v pulz ním poli A. Molekuly DNA o různých velikostech v prostředí bez elektrického pole B. Separace molekul v konvenční gelové elektroforéze (molekuly o velikosti 50 - 500 kb se pohybují stejnou rychlostí) C. Při pulzní elektroforéze je elektrické pole El přerušeno a nahrazeno polem E2 v jiném směru. Aby mohla DNA ve směru druhého pole migrovat, musí se nejdříve reorientovat ve směru u nového pole. Čím jsou molekuly větší, tím delší dobu spotřebují ke své reorientaci, a dochází tak ke zpomalení jejich pohybu. Pokud jsou obě pole stejná A- B- E< c-(směr, napětí, pulzní časy), bude výsledná dráha pohybu přímá, složená z jednotlivých „cik-cak" kroků. 5 kb * * • • •„* • • • • * 50 kb^ • • • • • • * • • # 500 kf^ • . # • • • • • ## • «• • • • • * ^* flnnrntí ir Pohyb DNA v agarózovém gelu při PFGE m mmmm 0.00 r 0.2 3 0.33 * * t ■ 0.40 0.50 Q 0.70 *1.á0 Označení systému používaných pfge pro pulzní elektroforézu PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis OFAGE Orthogonal Field Alteration Gel Electrophoresis TAFE Transverse Alterating Field Electrophoresis FIGE Field Inversion Gel Electrophoresis CHEF Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis RGE Rotating Gel Electrophoresis ZIFE Zero-Integrated Field Electrophoresis PHOGE Pulsed Homogeneous Orthogonal Field Gel Electrophoresis OFAGE TAFE K x FIGE CHEF a* rm T. t Ť T -V RGE +v Součásti aparatury pro PFGE Variable Speed Pump Temperature Probe Cable Cooling Module Straight Connector Electrophoresis Chamber Quick Release Connector Variable Speed Pump Cable CHEF Mapper Ftovuer Module Pump Connector To Interlock t Safety Interlock t 25 Pin cable Output to Cable Electrophoresis Cell Příprava vzorků pro PFGE Kultivace buněk do přesně stanovené hustoty Smíchání buněk s roztavenou agarózou (107 buněk/ml) Nalití směsi do malé formičky lyže buněk v agarózových bločcích deproteinace DNA ^ Promytí a odstranění proteinázy K »«* rig 0 0 0 r^^cD Ceils Cells & Agarose Solution (fenyl-metyl sulfonyl fluorid, PMSF) j ^ Štěpení reštrikční endonukleázou, □ □ □ □ %£58KF která štěpí s nízkou frekvencí e$%$^ ^ (velikost fragmentů 50- 10 000 kbp) \ eSSi& Vlastní PFGE 5- 10 |ug DNA v jamce Barvení gelu v etidiumbromidu 555 1 2 3 Schéma přípravy vzorků pro PFGE Buněčná kultura, jednobuněčné organizmy Shromáždit centrifugací Živočišná nebo rostlinná tkáň I Disociovat Koncentrovat bílé krvinky Krev Optimálně štěpit buněčnou stěnu Promýt buněčnou suspenzi I Stanovit koncentraci buněk a naředit na příslušnou hodnotu -► * Smíchat buňky s nízkotající agarózou a nalít do formičky —;-' I Štěpit proteiny proteinázou K v pufru s EDTA a detergenty * Důkladně promýt v pufru s EDTA Alternativně odstranit proteinázu K pomocí PMSF Skladovat v pufru s EDTA Výběr vhodných restrikčních enzymů pro makrorestrikční analýzu DNA 1. Výběr na základě délky rozpoznávací sekvence RE Délka rozpoznávací sekvence by měla být ^ 6 bp SfiL 5' GGCCN^NGGCC 3' příklad RE s 10 bp rozpoznávací sekvencí I-Scel 5' TAGGG^ATAAŤCAGGGTAAT 3' příklad intronem kódované endonukleázy s 18 bp dlouhou rozpoznávací sekvencí 2. Výběr na základě obsahu GC Bakteriální druhy se velice liší v obsahu GC v jejich genomech. Enzymy s GC-bohatou rozpoznávací sekvencí jsou vhodné pro AT-bohaté genomy Smal 5'CCC^GGG3' Notl 5'GC^GGCCGC 3' a enzymy s AT-bohatou rozpoznávací sekvencí jsou vhodné pro GC-bohaté genomy. Sspl 5' AAT^ATT 3' Swal 5* A ľ ľ ľ^AAA ľ 3* 3. Výskyt určitých sekvenčních motivů v rozpoznávací sekvenci Přítomnost sekvence odpovídající terminačnímu kodonu v rozpoznávacím místě RE může ovlivnit ftrekvenci štěpení. Xbal 5' T>lcfrAG|A 3' amber 4. Reštrikční endonukleázy citlivé na metylaci typu CpG jsou vhodné eukaryotické DNA Některé enzymy neštěpí DNA jestliže se v rozpoznávacím místě vyskytuje 5-metylcytozin. Mlul 5' A^CGCGT 3' tento enzym štěpí savčí DNA méně často než Sfil Využití PFGE pro diagnostické a typizační účely - makrorestrikční analýza 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Intrpretace výsledků PFGE při typizaci bakterií Typ genetické změny Původní počet fragmentů Výsledek v PFGE ve vztahu k standardnímu kmeni Výsledný počet fragmentů Bodová mutace tvorba RE-místa 5 Ztráta 1 fragm. standardního kmene, vznik 2 menších fragm. (suma velikostí se rovná velikosti fragm. st. kmene) 3 rozdíly ve fragmentech 6 Bodová mutace ztráta RE-místa 5 Vznik nového většího fragm., nepřítomného u st. kmene a ztráta 2 malých fragm. 3 rozdíly ve fragmentech 4 Inzerce fragm. DNA bez RE-místa 5 Počet fragm. stejný, vznik většího fragm. 2 rozdíly ve fragmentech 5 Delece fragm. bez RE-místa 5 Počet fragm. stejný, vznik menšího fragm. 2 rozdíly ve fragmentech 5 Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu při PFGE /. Velikost molekuly DNA 2. Koncentrace gelu 3. Konformace DNA 4. Aplikovaná voltáž (V/cm) 5. Teplota 6. Směr elektrického pole a reorientační úhel 7. Pulzní intervaly 8. Složení elektroforetických pufrů Volba pulzních intervalů v závislosti na velikosti separovaných molekul přesné hodnoty je možno určit pomocí softwaru 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 160C 0 1000 2000 30O0 4O00 5000 6000 Size (kb) Size (kb) Používané standardy velikostí pro PFGE Konkatemery plazmidů Konkatemery DNA fága lambda - Velikost monomeru 48,5 kb Makrorestrikční fragmenty bakteriálních genomů - Staphylococcus aureus 1000 kb - Escherichia coli Chromozomy kvasinek - Saccharomyces cerevisiae (240-2200 Kb) - Schizosaccharomyces pombe (3,5-5,7 Mb) - Hansenula wingei (1,0-3,1 Mb) - Candida albicans (1,0-4,0 Mb) Chromozomy Dictyostelium discodium (3,6-9,0 Mb) Chromozomy Neurospora crrassa (4,0-10,3 Mb) Lambda ladder S. pombe S. cerevisiae 50 kb 5,7 Mb 2200 kb 4,7 Mb • • — — 3,5 Mb 225 kb 25-90 s 1 800 s Pulzní časy 60-120 s Problémy při PFGE 1. Optimální vzorek 2. Vysoká koncentrace buněk 3. Nízká koncentrace buněk 4. Nedokonalé promíchání buněk s agarózou 5. Degradace DNA při izolaci nebo štěpení 6. Bloček agarózy je v jamce vertikálně 7. Bloček se během nanášení rozlomil 8. Bloček je v jamce umístěný zešikma 9. Částečné štěpení DNA (vzorek vpravo) 10. Částečné ětěpení DNA v části bločku vyčnívající z pufru 11. Nedostatečné chlazení nebo není vodorovná podložka 12. Příliš krátké pulzní intervaly 13. Příliš dlouhé pulzní intervaly