Úloha 2: Pulzní gelová elektroforéza (PFGE) a izolace bakteriální DNA pro PFGE
Pulzní gelová elektroforéza (PFGE) je elektroforetická metoda umožňující na rozdíl od klasické elektroforézy efektivní dělení molekul DNA větších než 15 kb (až do velikosti několika Mb).
Při pulzní elektroforéze se periodicky mění orientace elektrického pole (Obr.l). Molekuly DNA vagaróze se relaxují při odstranění jednoho pole a zaujímají určitou konformaci při působení nového pole. Tento proces reorientace je závislý na velikosti molekul.
Při přípravě vzorků větších než 500 kb je nutné molekuly DNA chránit před mechanickým poškozením (působení střižných sil) a před nukleolytickou degradací během izolace. Proto se používá speciální metoda izolace, při které jsou buňky nejprve fixovány v nízkotající agaróze a teprve potom je prováděna lyže a pufifikace DNA (Obr. 2).
Obr. 1: PFGE: elektrické pole se periodicky mění ve třech směrech (a) směrem od středu gelu, (b, c) v úhlu 60° po obou stranách gelu.
Obr. 2: Obecné schéma přípravy vzorků pro PFGE
Bunečná kultura, jednobuněčné organizmy
Shromáždit centrifugací
Živočišná nebo rostlinná tkán
Krev
Disociovat    Koncentrovat bílé krvinky
Optimálne štěpit bunečnou stenu
Promýt bunečnou suspenzi
Stanovit koncentraci buněk a naredit na príslušnou hodnotu
-. I
Smíchat buňky s nízkotající agarózou a nalít do formičky
—-' *
Štěpit proteiny proteinázou K v pufru s EDTA a detergenty
Důkladné promýt v pufru s EDTA Alternativně odstranit proteinázu K pomocí PMSF
Skladovat v pufru s EDTA
Postup izolace DNA pro PFGE ze stafylokoků kultivovaných v tekutém médiu
Seznam materiálu:
• Bakteriální kultura inkubovaná v 2xYT médiu při 37°C/18h.
• 37°C inkubátor, vortex.
• Skleněné 10 ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem.
• Vodní lázeň předehřátá na 55°C.
• SeaKem Gold agaróza (Lonza), Pulsed Field Certified Agarose (Bio-Rad)
• TE pufr (10 mM Tris. CI, 1 mM EDTA, pH 8,0), 0,5M EDTA, promývací roztok (10 mM TrisCI, 10 mM EDTA, lOmM EGTA, IM NaCI, pH 7,5), lyzostafin (0,5 mg/ml), lyzační roztok (6 mM Tris. CI, 100 mM EDTA, 1 M NaCI, 0,5% Brij 58, 0,2% Na-deoxycholát, 0,5% laurylsarkosin, pH 7,6), deproteinizační roztok (25 mM EDTA, 20 mM EGTA, 1% laurylsarkosin, pH 9,0), lysozym (50mg/ml), proteináza K (10 mg/ml)
• Vhodné reštrikční enzymy (pro 5. aureus používáme Smal).
• Sterilní deionizovaná voda, mikrozkumavky.
Postup:
1. den:
1. Zaočkovat kulturu do 20 ml 2x YT média a inkubovat 18 h při 37 °C
2. den:
2. Odebrat 10 ml kultury, přidat 100 u.1 0,5 M EDTA a chladit kulturu 10 min. při 4 °C.
3. Centrifugovat 10 min. při 4 °C a 4000 ot./min.
4. Dvakrát promýt v 5 ml promývacího roztoku zchlazeného na ledu.
5. Naředit promývacím roztokem na hodnotu optické hustoty OD600 = 0,2 - 0,3.
6. Centrifugovat 10 min. při 4 °C a 4000 ot./min., slít supernatant a odsát zbytky roztoku, tak, aby nedošlo k porušení peletu
7. Sediment resuspendovat ve 100 u.1 promývacího roztoku a přenést do mikrozkumavek.
8. Mikrozkumavky se suspenzí postupně zahřívat 2-3 min. na 55 °C.
9. Přidat 10 u.1 lyzostafinu (zásobní koncentrace 0,5 mg/ml), přidat 110 u.1 2% agarózy s nízkým bodem tání (roztok v 50 mM Tris. Cl, 5 mM EDTA, pH 8,0) předem vytemperované na 55 °C a promíchat pipetou, aby nevznikly bubliny.
10. Suspenzi přepipetovat po 200 u.1 do komůrek tvořítka a uložit na 20-30 min. do lednice.
11. Vzniklé agarózové bločky přenést do lyzační směsi, která obsahuje 1 ml lyzačního roztoku a 20 u.1 lyzostafinu (zásobní koncentrace 0,5 mg/ml), a inkubovat je za mírného třepání ve vodní lázni o teplotě 37 °C pro dobu 2 až 3 hodin.
Pozn.: Lyzační roztok připravujeme do skleněných zkumavek se šroubovacím uzávěrem.
Jednotlivé roztoky dále jen vyměňujeme a s bločky nemanipulujeme.
Pokud nedojde v tomto kroku k projasnění bločků, ponecháme lyžovat přes noc při 4 °C.
12. Lyzační směs vyměnit za směs deproteinizační, která obsahuje 1 ml deproteinizačního roztoku a 25 u.1 proteinázy K (zásobní koncentrace 20 mg/ml), a inkubovat bločky za mírného třepání ve vodní lázni o teplotě 55 °C po dobu 12 hodin (roztok vyměnit po šesti hodinách). Pozn.: Předem vyhřát lázeň na 55°C.
3. den:
13. Bločky promýt alespoň 5x v 10 ml lx TE pufru při 4 °C, TE pufr vyměňovat po 1,5 hodinách, průběžně chladit na 8 °C.
14. Bločky lze po důkladném promytí štěpit reštrikční endonukleázou (nejčastěji štěpíme přes noc).
Pozn.: nenaštěpené bločky je možné je skladovat po dobu 1 roku v lednici (TE pufr vyměňovat jednou za měsíc).
Reštrikční štěpení (postup)
• Pro reštrikční štěpení uřízneme z bločku vzorek o velikosti cca 1x1x5 mm.
• S bločky manipulujeme sterilně pomocí nerezových špachtlí, které sterilizujeme v etanolu a následným ožíhnutím nad plamenem.
• Bločky řežeme pomocí ostrého skalpelu, nejlépe na sterilní Petriho misce, kterou si můžeme podložit tmavou podložkou pro lepší manipulaci.
• Vlastní štěpení:
o  Do mikrozkumavky namíchat reštrikční směs (na 1 vzorek: 10 u.110x restrikčního pufru, 85 u.1 vody a 5-10 U restrikčního enzymu). Inkubujeme při požadované teplotě několik hodin nebo přes noc.
4.-5. den:
15. Vlastní provedení PFGE.
Příprava gelu a nastavení elektroforézy (poznámky)
• Připravit 1,2% agarózový gel v lxTAE pufru. Vychladit 2000 ml lxTAE pufru v elektroforetické vaně.
• Připravit 0,8% low-melting agarózu v lxTAE pufru vytemperovanou na 45°C pro zalití bločků do gelu.
• Jednotlivé bločky vkládáme pomocí nerezové špachtle do jamek připraveného gelu (mezi jednotlivými vzorky špachtli sterilizujeme).
• Jamky s bločky zakápnout připravenou 0,8% low-melting agarózou.
• Podmínky elektroforézy pro rozdělení Smal fragmentů chromozomální DNA 5. aureus:
o Pulzní časy 1 - 70s, lineární vzestup
o Teplota 14°C.
o Napětí 6 V/cm.
o Čas cca 24 h. pro gel délky 14 cm.