5. Úloha: Stanovení počtu kopií plazmidů (plasmid copy number - PCN) v buňce pomocí OPCR Cílem této úlohy bude stanovit počet kopií penicilinázového plazmidu u Staphylococcus aureus (pUSA300HOUMR-like) na bakteriální buňku pomocí QPCR. Absolutní kvantifikací stanovíme počet kopií genu blaZ lokalizovaného na plazmidu a bakteriálního genu mecA lokalizovaného v jedné kopii na bakteriálním chromozomu. Přesný počet plazmidů na buňku (PCN) stanovíme podle vztahu: velikost chromozomální DNA [bp] x množství plazmidové DNA [pg] velikost plazmidové DNA [bp] x množství chromozomální DNA [pg] Přesný postup: nastudujte samostatně z článků Lee CL. - Ow D.S. - Oh S.K. Quantitative real-time polymerase chain reaction for determination of plasmid copy number in bacteria. J Microbiol Methods, 2006, 65: 258-267. Lee C et al. Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli. J Biotechnol., 2006, 123: 273-280. Materiál: • Celogenomová bakteriální DNA pro přípravu kalibrační přímky, desítkové ředění od 100 ng do 0,1 pg (1. Skupina). Kvantifikace bakteriálního genu mecA lokalizovaného na bakteriálním chromozomu. • Plazmidová DNA pro přípravu kalibrační přímky, desítkové ředění od 100 ng do 0,1 pg (2. skupina). Kvantifikace plazmidového genu blaZ nebo řeř/Cv závislosti na typu kvantifikovaného plazmidu (pT181 nebo pUSA300-HOUMR-like). • DNA neznámých vzorků. • LightCyder® 480 SYBR Green I Master (protokol na stránkách výrobce https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/c5c29b3a-97ed-e311-98al-00215a9b0ba8) • RT-PCR grade water Pro qPCR je používán přístroj značky Roche - Light Cycler 480 II. Všechny reakce jsou připravovány v triplikátech v optických 96-jamkových destičkách. Reakční směs je připravována v objemu 10 u.1 a obsahuje 5 u.1 2x konc. Master Mix (Roche), primery o výsledné koncentraci 300 u.M, příslušnou DNA v celkovém objemu 1,25 u.1. Standardní řada pro qPCR je připravena 10-ti násobným ředěním plazmidové a celogenomové DNA. Standardní ředící řady jsou ideálně připravovány ze zásobních vzorků celogenomové DNA a jsou skladovány při -20°C. Postup: 1. Izolace plazmidové a celogenomové DNA pro přípravu kalibrační přímky. Izolace celogenomové DNA neznámých vzorků (připraveno předem). 2. Příprava kalibračních řad: • Dvě různé kalibrační přímky: I. skupina (Tab.l): - kalibrační přímka z celogenomové bakteriální DNA (kmen Jevons B) pro stanovení počtu kopií genu mecA, ředění připravit v koncentracích: 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg a 0,1 pg - kalibrační přímka bude mít celkem sedm datových bodů a každé ředění bude pipetováno na 96-jamkovou destičku v triplikátu (př. 100 ng - jamky A1-A3) - z důvodů stanovení průměrné hodnoty Q a standardní odchylky. II. skupina (Tab.ll): - kalibrační přímka z plazmidové bakteriální DNA (kmen Jevons B) pro stanovení počtu kopií genu blaZ, ředění připravit v koncentracích: 30 ng, 3 ng, 0,3 ng, 30 pg, 3 pg, 0,3 pg a 0,03 pg - kalibrační přímka bude mít celkem sedm datových bodů a každé ředění bude pipetováno na 96-jamkovou destičku v triplikátu (př. 30 ng - jamky A1-A3) - z důvodů stanovení průměrné hodnoty Q a standardní odchylky. 3. Připravit Master Mix: Objem [ul] Master Mix lx ...X SYBR Green 1 Master 5 Primer R (5uM) 0,75 Primer F (5uM) 0,75 PCR voda 2,25 DNA 1,25 Celkem 10 4. Do jamek na 96 jamkové destičce pipetovat 17,5ul takto připraveného mastermixu (triplikáty viz Tab. I a II). 5. Do jamek dle Tab. I a II napipetovat DNA kalibrační přímky a neznámých vzorků (2,5 ul/jamka). Pracovat rychle, reagencie chladíme na ledu, destičku nevystavujeme zbytečně dlouho přímému světlu. 6. Do jamek označených jako „non template" pipetujeme pouze vodu - slouží jako negativní kontrola. 7. Provést Q.PCR, po skončení běhu stanovit Treshold a jednotí ive Q.. 40x Program reakce: I. Iniciační denaturační krok : 95°C/10 min. II. 95°C/15 s III. 60°C/45s IV. disociační krok: 95°C/15 s; 60°C/60 s; 95°C/15 s; 60°C/15 s 8. Vypočítat účinnost PCR z grafu: hodnoty log. ředění vs. průměrné hodnoty Q, zjistit E, E%, R2, směrnici přímky (k) - vzor viz Tab. III, Graf I. Dle vzorců: Výpočet efektivity reakce (E) y=ax+b; kde a=k Směrnice (k)= -Log (E+l) E=101/k E[%]= (E-l)xlOO Stanovení PCN - výpočty do protokolu Z dat uvedených v pdf souborech, které exportujete po dokončení reakce: 1. Vytvořte graf závislosti log koncentrace na Cp standardu a neznámých vzorků - proložte datové body regresní přímkou a vypočítejte rovnici přímky a R2 pro oba běhy (kvantifikace genu blaZ a genu mecA) do jednoho grafu - vypočítejte a uveďte efektivitu obou běhů v % - zdůvodněte proč je hodnota E menší případně větší než 100% - srovnejte svoje výpočty s výsledky uvedenými v pdf souborech 2. Vypočítejte hodnoty PCN pro oba neznámé vzorky podle vztahu uvedeného v zadání úlohy Tabulka I: Příprava kalibrační přímky pro gen mecA Kalibrační přímka pro primery mecA1575 a mecA 1657 (300 nM, 300 nM) celogenomová DNA Jevons B Wells Master Mix For war d primer 5nM Reverse primer 5nM Koncentrace DNA Templát PCR voda Konečný objem A1-A3 5 0,75 0,75 100 ng 1,25 2,25 10 A4-A6 5 0,75 0,75 10 ng 1,25 2,25 10 A7-A9 5 0,75 0,75 1 ng 1,25 2,25 10 A10-A12 5 0,75 0,75 0,1 ng 1,25 2,25 10 B1-B3 5 0,75 0,75 0,01 ng 1,25 2,25 10 B4-B6 5 0,75 0,75 0,001 ng 1,25 2,25 10 B7-B9 5 0,75 0,75 0,0001 ng 1,25 2,25 10 počet vzorků Mast er Mix F primer R primer PCR voda ul celogenomová DNA Vzorek Wells Master Mix Forward primer 5nM Reverse primer 5^M Koncentrace DNA Templát PCR voda Konečný objem 07/629 C1-C3 5 0,75 0,75 10 ng 1,25 2,25 10 07/629 C4-C6 5 0,75 0,75 1 ng 1,25 2,25 10 5 0,75 0,75 1,25 2,25 10 5 0,75 0,75 1 ng 1,25 2,25 10 Bez tem. D1-D3 5 0,75 0,75 - 0 3,5 10 Tabulka II: Příprava kalibrační přímky pro gen blaZ Tabulka II: Kalibrační přímka pro primery blaZ-F a blaZ-R (300 nM, 300 nM) plazmidová DNA 5. aureus Jevons B Wells Master Mix Forwar d primer 5uM Revers e primer 5uM Koncentrac e DNA Templát PCR voda Konečn ý objem počet částic přepoče t A1-A3 5 0,75 0,75 30 ng 1,25 2,25 10 A4-A6 5 0,75 0,75 3 ng 1,25 2,25 10 A7-A9 5 0,75 0,75 0,3 ng 1,25 2,25 10 A10-A12 5 0,75 0,75 0,03 ng 1,25 2,25 10 B1-B3 5 0,75 0,75 0,003 ng 1,25 2,25 10 B4-B6 5 0,75 0,75 0,0003 ng 1,25 2,25 10 B7-B9 5 0,75 0,75 0,00003 ng 1,25 2,25 10 počet vzork ů Mastě r Mix F prime r R prime r PCR vod a ul celogenomová DNA Vzorek Wells Master Mix Forwar d primer 5uM Reverse primer 5uM Koncentrac e DNA Templá t PCR voda Konečn ý objem 07/629 C1-C3 5 0,75 0,75 10 ng 1,25 2,25 10 07/629 C4-C6 5 0,75 0,75 lng 1,25 2,25 10 5 0,75 0,75 1,25 2,25 10 5 0,75 0,75 1,25 2,25 10 Bez tem. D1-D3 5 0,75 0,75 - 0 3,5 10 Tab. III: Předpokládaný výsledek blaZ 1 2 3 4 5 6 genomova DNA Tr.COL 124 ng genomova DNA Tr.COL 12,4 ng genomova DNA Tr.COL 1,24 ng Efektivita Efektivita % Qty(pg/ul) 14000 1400 140 14 1,4 0,14 403000 96200 10400 1,951651 95 log Qty 4,146 3,146 2,146 1,146 0,146 -0,8539 5,605 4,983 4,017 Ct (prumer) 13,5308 17,168 20,6172 24,2799 27,5558 30,6694 8,7016 10,8138 14,1348 StDev +/- 0,0898 0,1136 0,0741 0,0594 0,1389 0,3111 0,2667 0,0629 0,0612 mecA 1 2 3 4 5 6 genomova DNA Tr.COL 124 ng genomova DNA Tr.COL 12,4 ng genomova DNA Tr.COL 1,24 ng genomova DNA COL 109 ng genomova DNA COL 10,9 ng genomova DNA COL 1,09 ng Efektivita reakce Efektivita reakce (%) Qty(pg/ul) 29700 2970 297 29,7 2,97 0,297 103000 14100 927 126000 20700 2610 1,914186 91% log Qty 4,473 3,473 2,473 1,473 0,473 -0,527 5,013 4,149 2,967 5,100 4,316 3,417 Ct (prumer) 13,049 16,444 20,02 23,754 27 30,793 11,108 14,128 18,367 10,772 13,542 16,722 StDev +/- 0,041 0,043 0,043 0,119 0,166 0,138 0,333 0,012 0,328 0,2 0,141 0,046 Grafl. Plasmid copy number in bacterial cell 35 - ♦ plasmid DNA- gene blaZ A genomic DNA - gene mecA -Regression line of genomic DNA (gene mecA) 25 - ^^E-;^. -Regression line of plasmid DNA (gene blaZ) Ct 20 - 15 -10 -5 - y = -3,5463x + 28,839 ^^==55^^ R2 = 0,9997 y = -3,4435x + 27,971 R2 = 0,9992 0 iii -2 -1 0 1 2 3 4 5 log c [pg]