Cytologie a morfologie bakterií Anthony van Leeuwenhoek Z 50 – 275 x, 17.stol Janssenovi Z 9 x, ~1595 Anthony van Leeuwenhoek První nákresy bakterií (z ústní dutiny člověka) SEM Treponema pallidum útočící na membránu savčí buňky I. Unikátní vlastnosti prokaryotických buněk • phschool.com http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/5a/Average_prokaryote_cell-_en.svg/1258px-Ave rage_prokaryote_cell-_en.svg.png Bakteriální prokaryotická buňka obvykle samostatné buňky Velmi málo vnitřních struktur Většina dějů na CM membráně Zvláštnosti prokaryotické buňky •živý, otevřený systém schopný regulace a autoreprodukce •jádro neodděleno od CPL membránou, větš. kruhová (i lineární) DNA •haploidní buňky (1 alela) množící se nepohlavně •bez buněčných organel, jediná membrána je cytoplasmatická •ribosomy se liší od ribosomů eukaryotních buněk – menší, volně v CPL vyjma Archea: •5S, 16S a 23S rRNA • translace začíná N-formylmethioninem • geny pro RNA bez intronů •specifické struktury a vlastnosti bakt. buňky: • peptidoglykan (až na mykoplasmata) • steroly v membránách zcela výjimečně • bičík – globul. bílk. flagelin, pohyb rotací • anaerobiosa, schopnost vázat N • tvorba kyseliny PHB (zásob.l.) • pokud fotosyntéza - anoxigenní bakteriální ribozom G- G+ E. coli S. aureus peptidoglykan Cytoplazma – difúze nebo řízené reakce? •Přeplněná ale organizovaná • př: 72 000 ribozomů v exponenc. fázi – specif. interakce s RNA • •Polarizovaná • polarita buňky dána - aktinovými centry – bakteriální cytoskelet • - umístěním CM receptorů •polarita zabezpečuje •pohyb b. •adhezi b. (receptory, pilli větš. na pólech buňky) •vstup do hostitele; fyziologické děje v urč. •kompartmentu • http://undsci.berkeley.edu/images/endosymbiosis/bacteriumdividing.jpg http://www.nature.com/nrmicro/journal/v6/n1/images/nrmicro1814-f3.jpg •Bakteriální cytoskelet • • Bakteriální buňka obsahuje řadu vláknitých proteinů nutných pro • •regulaci tvaru buňky •buněčné dělení a •segregaci chromozomů •rozdělování plazmidů •buněčné polaritě • •Jsou analogické všem třem cytoskeletárním • strukturám eukaryotní buňky • 3D strukturou a biochemickými vlastnostmi. • (Yu-Ling Shih and Lawrence Rothfield (2006): The Bacterial Cytoskeleton.Microbiology and Molecular Biology Reviews, p. 729-754, Vol. 70, No. 3; Michie KA, Löwe J. (2006): Dynamic filaments of the bacterial cytoskeleton. Annu Rev Biochem.;75:467-92). http://www.nature.com/nrmicro/journal/v12/n1/images_article/nrmicro3154-f2.jpg http://migration.wordpress.com/files/2007/07/cytoskel-homology.jpg http://www.ncl.ac.uk/camb/assets/photos/JEspo0J.JPG Buněčné struktury - cytologie •metody výzkumu • •PŘÍKLADY: •Složky peptidoglykanu (AMK, cukry) • napomáhají při taxonomických studiích • - složení PG, barvitelnost b. stěny, • serologie, fagotypizace •Výskyt typ.inkluzí – pomoc při identifikaci •Bičík – vztah mezi strukturou a mechanismem otáčení, který je různý u různých druhů!! • jejich vztah k fyziologii a taxonomii Peptidoglykan = uniformní disacharid N-acetylglukózamin + N-acetylmuramová Stěna spory: jiné a unikátní složení peptidoglykanu! Acidorezistentní mykobakteria, nokardie.. nebarvitelné Gramem: N-glykolylmuramová Vztah mezi tvarem buňky a počtem disacharidových jednotek v peptidoglykanu (10 - 65) Tetrapeptid L- a D-AMK Spojení: rozdíl v pozici 3 Inter- pepti- dový můstek Micrococcaceae – až druhově charakteristická struktura můstku Streptomycety: 3 pozice unikátní L-amino DAP kyselina CHEMOTAXONOMIE: Aminkokyselinové složení tetrapeptidu a můstku!! UKÁZKA_2 • rotace bičíku kolem vlastní osy – pouze u prokaryot • poháněn proton motive force (pmf) – pohyb protonů přes CM • Regulace pomocí MCP systému = proteiny Archea – extrémní podmínky: • •PEPTIDOGLYKAN • 5 typů buněčné stěny •CM – 1 vrstevná • Bacteria vs. Archaea !! strukturní shody ale rozdílné chemické složení •---- rozdílná citlivost na ATB • tRNA archeí podobná eukaryotické Archaean diagram phospholipid diagram Cytoplazmatická membrána archeí Sulfolipidy, glykolipidy, nepolární isoprenoidní lipidy, fosfolipidy, větvené lipidy, mnoho proteinů v membráně FOSFOLIPID: (1) chiralita glycerolu (L-glycerol; dáno enzymy) (2) etherové vazby - glyceroldiether, tetraether = jiné chem.vlastnosti fosfolipidů (3) řetízky isoprenoidů namísto MK (4) větvení isoprenoidu Nepřítomnost sterolů • • Často jednovrstevná glycerolové jednotky na obou koncích MK tvoří 1vrstvu Lepší přizpůsobení extrémům – monolayer rezistentnější k narušení teplem II. Příklady variability struktur bakteriální buňky Příklady faktorů ovlivňujících morfologii a funkci struktur bakteriální buňky In vivo?? In vitro??? Cytoplazma •Prostorová organizace (vysoký stupeň) • - řízeno ATPázami, protonovým gradientem membrány, aktinovými vlákny – udělují polaritu • - maximální hustota a rychlost a specifita reakcí • •Mobilizace cytoplazmy (difúze? X) • – řízeno IR zářením a generováním vody exkluzní zóny • •Mikroskopická struktura - gel Nukleoid, plazmidy •ATPáza ParA • - aktivní rozdělování nízkokopiových plazmidů • - par-geny i na chromozomu! • - par-geny kódují – centromeru a trans-acting proteiny a,b •TEM •Nukleoid jako biosenzor – detekce Hg.... •HU proteiny – konzervované; nadšroubovice, 3D, + ncRNA – komplex – architektura chromozomu • Biogeneze CM membrány •Při kolonizaci u parazitů •shift •Cílová léčba: ovlivnění mechanismů transportu beta-barelů •Mikroskopie – nutno zvoli vhodný typ techniky dle • sledované struktury • př: EM – 3 typy – mesozomy, nukleoid, cytoskelet • - dehydratace, pokovování – agregace nukleoidu • artefakty III. Volba správného typu mikroskopie pro pozorování cytologických a morfologických znaků Světelný mikroskop (1000x) vs. Elektronový (100 000x) • http://www.fzu.cz/sites/default/files/images/popularizace/em1.png http://img13.imageshack.us/img13/7915/090419200651large120694.jpg http://usa.chinadaily.com.cn/world/attachement/jpg/site1/20110526/001aa018f83f0f485f3e0b.jpg http://faculty.ccbcmd.edu/courses/bio141/labmanua/lab16/gramstain/images/gnrod.jpg Světelný mikroskop - Jasné pole http://textbookofbacteriology.net/EcoliO157H7.jpeg Světelný mikroskop - Fázový kontrast • http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/bc/E_coli_at_10000x%2C_original.jpg/1024px-E_ coli_at_10000x%2C_original.jpg Rastrovací elektronová mikroskopie http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/microbiology/gram_stain/Gram_stain_images/E_coli_2000_P72 01172.jpg Jasné pole, 1000x Rastrovací elektronová mikroskopie (skenovací, řádkovací, Scanning Electron Microscope - SEM) Popularita SEM pramení z možnosti získat obrázky povrchů širokého spektra objektů https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQ45AqbYMM2rDbxq4v8aGG2BcZXfBZrLTqhHvRW8bT8p9z -Lxzt Salmonella under an electron microscope http://www.nti.org/media/images/Jan-23--Flu.gif?_=1327344798 http://images.fineartamerica.com/images-medium-large-5/e-coli-sem-spl.jpg https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR0t1YqlzWN6wyMG6lwLX5r2CpYg8zrV6l-ZGcPctwphRi 9ZFyS2A • Skenovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tuneling electron microscopy, STM) https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS_oxX3c8NtKEHUATcO_tiO-8jOOalHCIS8AVdK9SccsjY v4MH3 https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcT1HSAfrjT4DpWBijCGIOWxEfjBCUNbt3X44BCJA1i3kiB Z1DwBAw https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSdELAjVS4CqMAd1cPVPw4JMVy_I7RV0rjqqdh6YUmxvyw ufU-eBg http://www.icmm.csic.es/spmage/gallery/2009/view/view09_STM421703201556.jpg •Metoda umožňuje pozorovat detaily buňky a virových částic. •Ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní barvení solemi těžkých kovů, které nepropuštějí elektrony například uranyl acetát, molybdenan amonný. Transmisní elektronový mikroskop (TEM) http://www.marine.usf.edu/eml/images/bacteria4.jpg http://ej.iop.org/images/2043-6262/3/4/045007/Full/ansn444797f6_online.jpg Cytologie a morfologie buňky •PREPARÁT • - co chceme vidět? – podle toho preparát a typ mikroskopie • tvar buňky – fázový kontrast, barvený fixovaný prep. • • • • • • • • • pohyb buňky – fázový kontrast, fluorescence • barvené struktury – pomáhají identifikaci (PHB, síra..) • typ buněčné stěny – Gramovo a acidorezistentní b. • rychlá příprava nativního preparátu barvení buněk a spor za horka a struktur Gramovo barvení světelná mikro- skopie Světelná Fázový kontrast Fluorescenční Elektronová… U jednoho bakteriálního rodu různý vzhled char. tvaru buňky! •Př: tyčky bacilů •Haemophilus Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis 10 μm H. influenzae H. ducrei •Pseudomonas P. aeruginosa P. fluorescens Velikost a tvary bakteriální buňky velký poměr povrch/objem – velká plocha kontaktu buňky s prostředím •Velikost bakt b. v µm • •Chlamydia 0,3 x 0,3 •Bdellovibrio 0,8 x 0,3 •Rickettsia 1 x 0,3 •S. aureus 0,8-1 x 0,8-1 •E. coli 2-3 x 0,4-0,6 •B. subtilis 1,8-4,8 x 0,9-1,1 •Streptomyces vlákno x 0,7-1,6 •Chromatium 25 x 10 •Spirochety 500 •Tvary bakt. buňky •Koky - sférické, oploštělé, lancetovité • - diplokoky, streptokoky, tetrády, sarciny, stafylokoky •Tyčinky – rovné, zakřivené, větvící se, palisády pleomorfní •Kokobacily •Pupeny •Prostéky •Spirily •Hvězdice •Mycelia • 750 µm - největší známá prokaryotní buňka, objevená r.1999: Thiomargarita namibiensis Nejmenší (např. někteří příslušníci rodu Mycoplasma) měří 100 až 200 nm • • Morfologie •Buňky •Charakteristických shluků buněk •Buněčných útvarů (spory, • konidie, sporangia, pouzdra..) •Bakteriální kolonie Většinou druhově charakteristické = identifikační znak Pozor na: fázi růstového cyklu! endospory vyklenující buňku stáří kultury pleomorfní buňky Clostridium botulinum endospora buňka char.shluk kolonie sporangium spory Pleomorfní buňky rodu Corynebacterium Mycobacterium avium-intracellulare Acidorezistentní barvení buněk histologického řezu lymfatické uzliny Pleomorfní buňky M. tuberculosis Morfologie pleomorfních buněk. Další potíž: Jsou barvitelné Gramem? Haemophilus – ano Mykobakteria, mykoplazmata - nikoli Acidorezistentní buňky: Odmítají Gramovo barvení Odmítají se po nabarvení odbarvit ethanolem i kyselinou. Př: Nocardia… Bez b.s. Mykolové kys Bacillus megaterium ccm 2007 (nativni48noma) Bacillus megaterium ccm 2007 (3-nativni24-hallo) sarcina-nativni_5 Mycobacterium tuberculosis Zeihl-Neelsonovo barvení (červeně) Je neznámý vzorek vůbec barvitelný Gramem? Není gramlabilní? Fáze tyčka – kok? S barevným filtrem Cíl mikroskopie? Typ preparátu Typ mikroskopie (typ b. stěny, průkaz struktur, růstového cyklu) Živý (nativní) preparát bez fixace– vidíme nedeformovaný tvar buňky, spory, morfologii seskupení buněk, pohyb buněk Živé a mrtvé b., pohyb Fixov. prep. – tvar a typ b. Fixov. prep. nebarvitelný Gramem Bacillus anthracis Ústní mikroflora UKÁZKA 1 Lactococcus lactis Staphylococcus aureus na pokožce Proteus Streptomyces kolonie sporangium spory Produkce ATB Struktury G- buňky Le pto spi ra IV. •Buněčná stadia při dělení buňky Cytologické a morfologické proměny vstup parazitické, patogenní fáze do buňky (př: remodelace proteinů listerií) Struktury a jejich konformace závisí....... Od jakých procesů se odvíjí cytologie a morfologie bakteriálních buněk? •Prosté binární dělení •anebo •přítomnost růstových cyklů? Posuzujeme-li vzhled buňky kmene určitého bakteriálního druhu, je třeba si uvědomit: •1) Prochází sledovaný druh růstovým cyklem? •- v každém z nich má pak buňka jinou cytologii a morfologii • Př: Chlamydia, Bdellovibrio, Streptomyces, Caulobacter, myxobakterie…. •Mění se nejen vzhled buňky, •ale buňka v cyklech prochází •typickou změnou vnitřních •struktur. Buněčný cyklus Caulobacter crescentus Binární dělení bakteriálních buněk •Funkce bakteriálního cytoskeletu • (přepážka, pohyb struktur) •Ori C •Zdvojení genetické informace http://www.nature.com/nrmicro/journal/v10/n1/images/nrmicro2671-f1.jpg • Jiné životní cykly než binární dělení Střídání přisedlého a volného stadia http://www.hhmi.org/sites/default/files/Our%20Scientists/Investigators/jacobs-wagner_fig1_lg.gif Caulobacter http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e4/Aa_spha%C3%A9rotylus_doigt_fl.jpg http://cfs10.blog.daum.net/image/13/blog/2008/03/22/19/09/47e4dab2e392d&filename=%EA%B3%B0%ED%8C%A1 %EC%9D%B4.jpg Sphaerotilus • Jiné životní cykly než binární dělení Střídání infekčního a reprodukčního stadia http://pedsinreview.aappublications.org/content/25/2/43/F1.large.jpg Chlamydie – retikulární a infekční tělíska http://www.std-aid.com/wp-content/uploads/2012/07/ChlamydiaOfTheEye.jpg http://www.stdrapidtestkits.com/media/wysiwyg/labelle/chlamydiabac.png https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQ9th0qXSTsxWtRvbKG0_9nwOXroXvT2f6sliqx9dHdAde 5GnF4MQ http://microgen.ouhsc.edu/b_bacter/fig1.png • https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRBxt2SPfBBsdpMi8RBZ6BpLu4xeYnPHjIySokMwS20pPP JtYJnUQ Dravé Bdellovibrio Jiné životní cykly než binární dělení Parazitické bakterie http://3.bp.blogspot.com/_F9aX8QCeWZs/TAorAQe1STI/AAAAAAAABtc/xV33ZI3pQRw/s400/vampirococcus.jpg Vampirococcus https://c1.staticflickr.com/3/2717/4187842186_361aff8f78.jpg Jiné životní cykly než binární dělení • https://micro.cornell.edu/sites/micro.cornell.edu/files/shared/images/epulolife_3.jpg • Bacillus Bdellovibrio Myxobakterie •2) Vytváří posuzovaný druh endospory? •- v preparátu pak mohou měnit tvar buněk! „Voják umírající na tetanus“ Sir Charles Bell lukovité prohnutí zad (opistotonus) křečovitý výraz Originál je k vidění: Royal College of Surgeons of Edinburgh, Scotland. Clostridium difficile Clostridium tetani Bacillus anthracis Morfologie buňky uprostřed buněčného cyklu • Životní cyklus rodu Bacillus - u některých jeho druhů i u jiných rodů navíc různá barvitelnost Gramem při různém stáří buněk – až gramlabilní při popisu preparátu nutno uvažovat stáří buněk! Endospory vs. exospory •G+ bakterie – endospory termorezistentní Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces •G- bakterie – exospory Méně rezistentní, odolné zejm.vůči vysychání Azotobacter, Methylosinus ALE: Př: Coxiella je G- a tvoří endospory! •Konidie: Actinobacteria Azotobacter Sporosarcina – balíčky 8 buněk fázový kontrast •3) Stárnutím mění buňky tvar •4) Závislost tvaru buňky na vnějším prostředí -živiny, tlak, osmolarita… •5) pleomorfní buňky – př. rody Mycobacterium, Corynebacterium, Haemophillus, Mycoplasma • Corynebacterium Pleomorfní mykoplazmata: nejmenší bakteriální buňky (0,2 – 0,3 μm); bez buněčné stěny! Poté: Nepůsobí betalaktamy Osmoticky stabilní v host.b. 1μm velké buňky se v cyklu střídají s elementár.tělísky výběžky Co je možno vyčíst z tvaru buňky •tvar buňky napovídá o metabolické aktivitě •(kokovité buňky vykazují max. metabol. aktivitu) •fáze růstového cyklu • Morfologie charakteristických shluků buněk •typické shluky napomáhají identifikaci řetízky koků: Streptococcus řetízky bacilů: Bacillus palisády: Corynebacterium tetrády koků: Micrococcus balíčky = sarciny Sarcina hrozníčky: Staphylococcus Streptococcus Micrococcus Staphylococcus Bacillus • Mikrokolonie E. coli vznikající ze tří mateřských buněk (na agaru) - charakteristický vzhled vznikajících útvarů dělících se buněk u růz. rodů…. ASM Microbe Library. J. Shapiro and C. Hsu Morfologie bakt. kolonií • •potřeba zvážit typ media, ne kterém kolonie hodnotíme! • kultivace - zda vůbec kultivovatelné?? - sledování typu kolonií • stáří kultury •Př: sledování morfologie kolonií • – univerzální media, jiný vhled na • selektivním – zda vůbec růst či ne? barevná reakce?) • S-, R- a M-formy • sledování pohybu terasovité kolonie (Př: Proteus) • Proteus Proteus – pohyb buněk Bacillus mycoides Serratia marcescens Streptomyces Streptomyces Morfologie bakteriálních kolonií I. na základních půdách Nocardia E.coli na krevním agaru E.coli na MacConkey agaru Lac+ E.coli na agaru EMB (Eosin Methylene Blue Agar) Bakteriální kolonie na II. diagnost. půdách Jeden druh bakterie různá media E.coli na C.L.E.D. mediu Cysteine Lactose Electrolyte Deficient Agar Mycobacterium tuberculosis obohacená a selektivní Löwenstein-Jensenova medium selektivní až na kmen! Detekce kmene E. coli O157:H7 proti jiným kmenům E. coli Bakteriální kolonie na III. selektivních půdách DSCN0760 Kontaminace na misce! • • Děkuji za pozornost J Sylabus cvičení •Mikroskopické a makroskopické znaky; cytologie • 1) práce s čistými sbírkovými a smíšenými kulturami (izoláty) 26.9. v 9 h • a) práce s čistými sbírkovými kulturami • - mikroskopické techniky (jasné pole, fázový kontrast), preparát dle Grama a preparát nativní, porovnávání kultur, křížový roztěr, makrofoto, program na analýzu obrazu NIS • b) izoláty - zaočkování vlastní mikroflory • 2) Práce se a) smíšenými kulturami – pozorování mikroflory v preparátu • b) acidorezistentní vs. Gramovo barvení • 3) Morfologie sporulujících buněk (Bacillus; vliv media a délky kultivace), morfologie buněk vytvářejících cysty (Azotobacter) • 4) Vnitřní a vnější struktury • – inkluze – Bacillus, kvasinka (glykogen, lipidy, ..) • – bičíky – makroskopické znaky růstu bičíkatých kultury: založení kultivace v polotekutém mediu (miska i zkumavka) – Proteus, Bacillus, E.coli •5) Příprava sklíčkových kultur – skupina Actinomyces •6) Pozorování sklíčkových kultur 1) 1) Bezpečnost a zásady práce Plášť, přezůvky, skříňky, jídlo, pití Po vstupu do laboratoře či před zahájením práce prosím o mytí rukou; test účinnosti mytí rukou Stoly – před a po práci Incidur, ethanol MO – Biohazard group 0 Mytí rukou před návštěvou toalety!!! 29 !! : případně ethanol Kahan zapnutý jen po dobu práce s ním MO – Biohazard group 0 Nemluvit při očkování mikroorganismů Misky s bakteriálními kmeny otevírat co nejméně a po práci správně zavřít Sterilní práce – žíhání kličky v plameni kahanu.. 30 Popisování misek: zespodu, svrchu – dle metody!! O náplni cvičení se informovat předem Viz Studijní materiály - příprava Nevylévat nic do odpadu – stůl: odpadní nádobky Prosíme neodnášet kultury! 31